日本结缕草滞绿基因 ZjSGR 对烟草的转化及功能分析

SGR 基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。 本研究利用 DNA 重组技术,构建 35S::ZjSGR:YFP 植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR 和 qRT-PCR 结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。     

匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子的表达分析

为研究匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子在植物抗逆方面的功能,克隆了匍匐翦股颖的一个小热激蛋白HSP26.7基因的启动子并进行了序列分析;构建了同时具有该启动子序列和GUS报告基因的植物表达载体,并通过农杆菌侵染法转化拟南芥植株.结果显示:该启动子存在HSE,ABRE等响应高温和其他胁迫的调控元件,受高温胁迫强烈诱导,...     

广州地区几种草坪草低温胁迫效应研究

通过低温胁迫处理匍匐剪股颖粤选1号Agrostis stoloniferacv.Yuexuan No.1、伪针茅Pseudoraphisspinescens、狗牙根Cynodon dactylon、沟叶结缕草Zoysia matrella、长花马唐Digitaria longiflora5种草坪草,分别测定叶片、匍匐茎、根系质膜相对透性和根系活力以及田间草坪草叶片叶绿素含量。结果说明,低温胁迫下,草坪草叶片、匍匐茎、根系质膜相对透性显著增加,并且,沟叶结缕草膜透性最高,伪针茅与匍匐剪股颖膜透性总体上较低;低温胁迫下,伪针茅、匍匐剪股颖根系活力高,狗牙根根系活力低;冬季草坪草叶绿素含量为伪针茅>匍匐剪股颖(粤选1号)>长花马唐>狗牙根>沟叶结缕草。     

紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化

NAP转录因子是植物体内特有的转录因子,在调控植物生长发育、衰老速度以及响应生物、非生物胁迫等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆紫花苜蓿NAP转录因子基因,将其命名为MsNAP(GenBank登录号:KM211498.1),MsNAP编码区长822bp,编码274个氨基酸。生物信息学分析显示:其与其他物种NAP蛋白具有较高的同源性,与蒺藜苜蓿同源性最高。荧光定量技术分析结果显示:MsNAP基因在花中表达量最高,衰老叶片中的表达水平远远高于未衰老叶片。利用DNA重组技术将MsNAP基因完整编码区连接至植物表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-MsNAP,通过农杆菌介导方法转化烟草,PCR和RT-PCR检测结果显示,成功获得了转MsNAP基因的转基因烟草,初步证明在转基因烟草中外源基因MsNAP能够转录表达,为研究MsNAP基因功能奠定了基础。     

农杆菌介导的匍匐翦股颖胚性愈伤组织的转化和转CBF1基因植株的获得

以匍匐翦股颖成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法就不同的菌液浓度、共培养条件和真空处理等对愈伤组织的转化效率进行研究.结果表明,适宜的农杆菌侵染浓度光密度OD600nm为0.8～1.2,真空处理加全光照的共培养条件有助于提高转化效率;CBF1基因是来源于拟南芥的与抗逆相关的转录因子基因,在匍匐翦股颖中实现了其转化,通过PCR检测,50株转基因植株中32株扩增出640bp的目标片断,部分转基因植株生长缓慢,表现出矮化性状.非胁迫条件下,转基因植株游离脯氨酸含量为对照的5倍.断水处理5d后,转基因植株生长基本正常,脯氨酸含量增加约2倍,比对照植株高2～3倍.     

广州地区几种草坪草低温胁迫效应初报

通过低温胁迫处理匍匐翦股颖粤选1号、海滨雀稗、杂交狗牙根品种老鹰草、沟叶结缕草4种草坪草,测定膜透性、根系活力及叶绿素含量。结果表明,低温胁迫下,草坪草叶片,匍匐茎和根系质膜相对透性显著增加,并且,沟叶结缕草膜透性最高,匍匐翦股颖膜透性最低;低温胁迫下,匍匐翦股颖根系活力最高,老鹰草根系活力最低;叶绿素含量从高到低为匍匐翦股颖粤选1号>海滨雀稗>杂交狗牙根(老鹰草)>沟叶结缕草。     

干旱胁迫下丁二醇诱导对匍匐翦股颖幼苗生理生化指标的影响

为了研究丁二醇对匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)苗期抗旱性的调控效应,以匍匐翦股颖(PennA-4)种子为材料,进行沙培种植,待幼苗生长粗壮均匀时进行丁二醇的处理,5天后用15%的PEG进行模拟抗旱处理,分析苗期植株丙二醛(MDA)、可溶性糖、叶绿素、相对含水量、游离脯氨酸、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的变化规律及与植物抗旱性的关系。研究结果表明:与干旱胁迫处理相比,诱导处理显著提高了植株叶片相对含水量、脯氨酸以及叶绿素的含量,抑制了匍匐翦股颖中丙二醛(MDA)和可溶性糖的含量,同时提高了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并且使过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性有所降低。综上,在干旱胁迫条件下,外施丁二醇可提高翦股颖的抗旱能力,使其能够更好地适应干旱胁迫环境。     

渗灌和喷灌对匍匐剪股颖种子萌发与幼苗生长的影响

为探讨渗灌在草种发芽建坪上的应用,以匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)种子为试验材料,通过人工气候室盆栽试验,研究渗灌和喷灌2种不同灌溉方式对匍匐剪股颖种子萌发与幼苗生长的影响。结果表明:渗灌下种子发芽势显著低于喷灌。整个草坪建植期间,渗灌下草坪盖度显著低于喷灌。播种后30 d内,2种灌溉方式对匍匐剪股颖植株的生长影响较小,30 d后,渗灌下匍匐剪股颖的株高、单株总叶数、单株茎蘖数和垂直生长速度等指标均显著高于喷灌,其成坪后的单株生物量也显著高于喷灌,单株生长已能够弥补因种子萌发出苗较少的不足,成坪后2种灌溉方式在单位面积的群体生物量和根长上无显著差异,用渗灌方式建植匍匐剪股颖草坪可行。     

匍匐翦股颖AsSAUR71基因克隆及转化

以匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)Penn A-4品种为材料,利用PCR技术在匍匐翦股颖中克隆出SAUR71基因,构建3302Y-SAUR71植物表达载体,通过农杆菌侵染转化匍匐翦股颖。在遗传转化过程,愈伤组织继代培养基中添加0.3mg/L KT、0.1mg/L 6-BA与300mg/L水解酪蛋白以形成较多的分化率较高的胚性愈伤组织,在该愈伤组织诱导体系中出愈率达到57.2%。在进行诱导生芽生根过程中,提高KT与6-BA浓度促进愈伤组织分化,使愈伤组织分化率达到83.7%。在该转化体系中,通过PCR检测,最终获得24株转基因植株,为后续进行AsSAUR71基因功能的相关研究提供了基础。     

高羊茅应答盐胁迫的AtSOS途径基因的效应分析

本研究在2015年采用基因工程技术改良高羊茅耐盐性,通过种植转基因耐盐草坪草达到改良土壤改善生态环境的目的。以草坪草成熟种子诱导的胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法将拟南芥AtSOS途径基因AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3和AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3分别导入高羊茅爱瑞3号中,经PCR检测、Southern blotting分析和RT-PCR鉴定,获得了能稳定表达的转基因株系。以转不同组合AtSOS基因的高羊茅植株和野生型植株为材料进行盐处理,每次处理重复3次,测定其生理生化指标、株高、Na⁺、K⁺离子含量、叶绿素含量,结果显示,盐胁迫下转基因植株的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性都显著高于对照植株,而丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量的增加幅度均显著低于对照植株;盐胁迫下转基因和野生型植株叶片中的Na⁺、K⁺含量都增加;盐胁迫下所有植株的株高均呈下降趋势,各株系的叶绿素含量也减少,但是转基因(AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3)植株的叶绿素含量增加。转AtSOS基因的高羊茅通过发挥AtSOS途径的作用,促进了植物体内Na⁺的外排,减轻了盐胁迫所导致的伤害,提高了植物的耐盐性。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑日本结缕草ZjSGR基因技术研究

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28~30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P<0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。     

香樟凋落叶分解对3种草坪草的化感作用

为探讨白三叶(Trifolium repens)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)和沿阶草(Ophiopogon bodinieri)在香樟(Cinnamomum camphora)林下栽植的适宜性,采用培养皿萌发试验和盆栽试验,通过测定3种草坪草生长和抗性生理相关指标,综合评价3种草坪草对香樟化感的耐受性。结果表明,香樟凋落叶浸提液对3种草坪草的发芽有一定的抑制作用,其中沿阶草受香樟抑制作用最弱。随着土壤中凋落叶量的增加,3种草坪草株高、叶面积、生物量和叶片叶绿素含量均不断下降;白三叶和匍匐剪股颖的超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性显著降低(P<0.05),过氧化氢酶活性升高,沿阶草则变化不明显;匍匐剪股颖的丙二醛含量显著升高(P<0.05),其他两种草坪草不受影响。因此,相对于白三叶和匍匐剪股颖,沿阶草对香樟凋落叶分解产生的化感胁迫效应具有更强的耐受性,可能更适宜在香樟林下种植。     

2,3-BD多次诱导对匍匐翦股颖抗褐斑病的效果

试验研究了250μmol/L的2,3-BD分别进行1、2、3、4次诱导对匍匐翦股颖植株抗病性的影响,计算了各处理的病情指数、诱导效果并测定了抗病相关酶以及叶绿素和丙二醛(MDA)等的含量。结果表明:2,3-BD多次诱导能使匍匐翦股颖植株的抗病性提升,其中,2次诱导处理的病情指数最低,为24.60%、诱导效果最好,为65.05%,同时与其他处理相比,,2次诱导处理下的SOD、POD、CAT、PAL等酶的活性增加,始终高于对照且差异显著,MDA的积累量最低。综合分析2,3-BD能够提高匍匐翦股颖的抗病能力,且经过2次诱导处理的效果最佳。     

剪股颖对不同质量分数二甲四氯的适应性响应

通过田间试验,研究剪股颖Agrostis stolonifera对二甲四氯的适应性反应,试验设置5个处理,分别为0.8、1.66、3.32、6.64和13.28 mg/L,测定剪股颖4个不同时期的叶绿素含量、丙二醛和可溶性糖含量,试验结果表明:不同质量分数的二甲四氯对剪股颖4个不同生育时期的叶绿素、丙二醛及可溶含糖量有不同程度的影响,在剪股颖同一生长时期,随着二甲四氯质量分数的升高,剪股颖的叶绿素含量下降、丙二醛和可溶性糖含量升高,二甲四氯处理的初期,对剪股颖生长影响比较大,随着二甲四氯处理时间的延长,对剪股颖生长的影响逐渐减小.从而可以得出,适宜质量分数的二甲四氯处理对剪股颖生长的影响较小,可作为剪股颖草坪除草剂使用.     

农杆菌介导的Lyz-GFP基因对匍匐翦股颖Peen A-1 转化和表达的研究

 以匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１成熟胚为供试材料,建立了其植株高效再生体系。利用农杆菌介导法将溶菌酶与绿色荧光蛋白Ｌｙｚ-ＧＦＰ双元基因转入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１ 胚性愈伤组织中,经培养获得抗病转基因植株。并对Ｌｙｚ-ＧＦＰ双元基因转化ＰｅｎｎＡ-１的适宜条件进行了研究。研究结果表明,在２．０ｍｇ／Ｌ２,４ Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ６-ＢＡ的ＭＳ培养基上ＰｅｎｎＡ-１愈伤组织诱导率最高,可达３６％,且质量最好。愈伤组织在ＭＳＯ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 上分化率最高,达４２．５％;浓度为３００ｍｇ／Ｌ 的头孢霉素（Ｃｅｆ）可抑制农杆菌ＬＢＡ４４０４的生长;ＰｅｎｎＡ-１胚性愈伤组织经携有ｐＢＩ１２１-Ｌｙｚ-ＧＦＰ的农杆菌ＬＢＡ４４０４ （ＯＤ６００值０．３～０．５）侵染１０～１５ｍｉｎ,共培养３ｄ后,转化愈伤组织生长状况良好,转化率达１２．５％,且在后期的生长和转化苗的再生中有良好的表现,转化苗再生率为２７．５％;转化植株有较强的荧光表达量,并经ＰＣＲ 检测,获得的２株匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１转化植株中均扩增出７５０ｂｐ的目标基因片断。     

2,3-丁二醇诱导下匍匐翦股颖叶片细胞结构变化及抗病相关性分析

由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的褐斑病是匍匐翦股颖草坪最常见的病害之一,2,3-BD(2,3-butanediol)可诱导植物产生抗病反应,提高植物的抗病性。本试验采用250 μmol/L 2,3-BD诱导匍匐翦股颖对褐斑病的抗性,以石蜡切片方法通过显微观察,测定接种立枯丝核菌后匍匐翦股颖叶片细胞显微结构的变化。结果表明,接种病原菌后匍匐翦股颖病情指数第15天达到70.45%,2,3-BD诱导后病情指数显著降低至21.63%。与未诱导接菌处理相比,诱导后匍匐翦股颖叶片细胞结构排列紧密,气腔变小,有较多乳突形成,上、下表皮细胞显著增大,第7天差异最显著,分别是其1.19和1.26倍;叶肉细胞大小于第15天差异最为显著,是其1.30倍;叶绿体数量明显增加,第1、7、15天分别是未诱导接菌处理的1.25、1.20、1.24倍;维管束和导管大小在各时间段均变化不明显,但木质化程度较高,皮层组织加厚。综上所述,250 μmol/L 的2,3-BD能诱导匍匐翦股颖对褐斑病的抗性,并使细胞结构发生变化,其中叶片上、下表皮细胞、叶肉细胞大小和叶绿体数目与抗病性呈正相关性。     

农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化柳枝稷研究

为延长生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)的叶片功能期,以柳枝稷‘西稷1号’品系的成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化叶片衰老延缓基因P_SAG12-IPT.结果表明:经过农杆菌转化,共培养,抗性愈伤组织筛选、再生和生根培养,在农杆菌介导处理的8500块愈伤组织中共获得了320株转化植株;经PCR检测分析,转化植株中共有19株植株扩增出标记基因潮霉素B磷酸转移酶基因的目标片段,初步表明P_SAG12-IPT基因已整合到柳枝稷基因组中,转化率为0.223%.对柳枝稷转基因植株的叶片叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度和气孔导度进行测定,表明P_SAG12-IPT基因在部分转基因植株中已经表达.