华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^-1 甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10⁶个·g FW^-1,活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。     

提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究

为探讨影响胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batal.)原生质体游离的因素,提高原生质体游离产量和分裂频率,试验采用纤维素酶、果胶酶、离析酶不同浓度组合的酶解液,在3种酶解方式下对甘草叶片、下胚轴、愈伤组织进行了原生质体游离。结果表明:苗龄11 d的甘草叶片、下胚轴及继代5次的愈伤组织是原生质体游离的良好材料,三者均在2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶和2.0%纤维素酶+0.25%离析酶+0.5%果胶酶的酶解液中原生质体游离频率最高,其产量和活力分别为1.25×10⁵~1.26×10⁵个·g^-1,65.7%~70.5%;1.43×10⁵~1.44×10⁵个·g^-1,69.5%~72.8%;1.10×10⁵~1.16×10⁵个·g^-1,61.9%~69.4%;纵向切割的下胚轴平均原生质体产量和活力高于叶片和愈伤组织,分别为1.19×10⁵个·g^-1,65.2%。此外,在40 r·min^-1摇床上处理7 h的酶解混合物中原生质体产量最高;而先静置后缓慢震荡(40 r·min^-1)的酶解方式可得到最佳原生质体产量和活力。将原生质体密度调整到1×10⁵个·g^-1并培养于KM8P培养基中,能获得最高频率的原生质体分裂频率(2.34%)。试验获得了较好的甘草原生质体游离及分裂体系。     

匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立

为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）叶肉细胞原生质体瞬时表达体系，本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料，分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响，确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明：苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L^-1的酶解液中，28℃酶解4 h后，可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×10⁶个·g^-1；为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中，构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒，并在聚乙二醇（PEG-4000）介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位；通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述，本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系，为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。     

三种外源物质对低温胁迫下柱花草生理与荧光特性的影响

为研究不同浓度脱落酸、壳聚糖和水杨酸喷施对低温胁迫下柱花草叶片生理指标和叶绿素荧光特性的影响,以播种50 d的幼苗为试验材料,叶面喷施法处理后,于光照培养箱中连续进行7 d低温(昼夜温8℃/5℃),2 d常温(昼夜温28℃/25℃)处理。结果表明,不同浓度外源物质喷施使低温下柱花草叶片光合色素含量、抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量显著增加;寒害指数、相对电导率、丙二醛含量显著降低,继续2 d常温处理后,各项指标有所回升。经300 mg·L^-1壳聚糖、0.4 mmol·L^-1水杨酸和10 mg·L^-1脱落酸处理的植株,叶绿素荧光参数的最大光化学效率(F_v/F_m)、电子传递量子产额(φE₀)、性能参数(PI_ABS)分别显著升高了80.88%～122.57%、119.87%～170.53%和271.77%～580.49%;用于热耗散量子比率(φD₀)显著降低了26.39%～37.10%。经隶属函数法综合评价,壳聚糖、脱落酸...     

百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究

分别以百脉根里奥(Lotus corniculatus L.cv.Leon)无菌苗子叶及由下胚轴和子叶形成的胚性愈伤组织为供体材料,进行原生质体游离,研究不同酶解条件对原生质体分离的影响,以期为进一步开展属间体细胞杂交及培育新品种奠定研究基础。结果表明:子叶和愈伤组织原生质体分离最适的酶液组合均为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、以及0.55 mol·L^-1甘露醇,产量及活力分别可达4.13×10⁶个·g^-1,65%和3.8×10⁶个·g^-1,67.4%;最佳酶解时间分别为6 h和12 h。预培养8~10 d,CPW-10溶液中预质壁分离1 h或预暗培养1 d等预处理措施可显著提高愈伤组织原生质体的产量及活力(P<0.01)。     

外源褪黑素对盐胁迫下两种紫花苜蓿生理及光合特性的影响

为探究外源褪黑素(Melatonin, MT)对盐胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)生理及光合特性的影响,本研究以紫花苜蓿‘中苜1号’(耐盐)和‘渭南’(敏盐)为材料,根施浓度为25(MT1),50(MT2),70(MT3),100(MT4),150(MT5)μmol·L^-1的褪黑素预处理,用浓度为150 mmol·L^-1的盐溶液胁迫并分析处理前后紫花苜蓿幼苗生理及光合指标。结果表明：150 mmol·L^-1盐浓度使植株生长受明显抑制,当褪黑素浓度为50,70,100μmol·L^-1时可显著提高盐胁迫下2种紫花苜蓿幼苗叶片相对含水量、脯氨酸和叶绿素含量,降低相对电导率和丙二醛含量;各浓度褪黑素处理均显著提高2种紫花苜蓿的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性。50,70,100μmol·L^-1MT处理显著提高2种紫花苜蓿的净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率。外源褪黑素浓度为100μmol·L^-1时对...     

盐胁迫下黑果枸杞幼苗对外源独脚金内酯的生理响应

为探究盐胁迫下黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)幼苗生理特性对外源独脚金内酯(SLs)的响应，本研究以黑果枸杞为试验材料，采用浓度为50,100,150,200和250 mmol·L^-1的NaCl溶液进行盐胁迫处理，并对幼苗根部灌施0.4,1,5,10μmol·L^-1的SLs,测定并分析黑果枸杞幼苗的生理指标。结果表明：在轻度盐胁迫(50,100 mmol·L^-1 NaCl)下施加1,5,10μmol·L^-1外源SLs处理、中度盐胁迫(150 mmol·L^-1 NaCl)以及重度盐胁迫(200,250 mmol·L^-1 NaCl)下施加5,10μmol·L^-1外源SLs,测得幼苗中叶绿素含量、可溶性糖含量增加，SOD,POD,CAT,GSH,ASA活性上升，MDA含量显著降低(P<0.05)。因此，施加外源SLs能够增强黑果枸杞幼苗的抗盐性，且最佳使用浓度为5μmol·L^-1,本研究...     

扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究

以扁蓿豆(Melilotoides ruthenica(L.)Sojak)下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、继代培养时间及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的酶解条件。结果表明:获得有活力原生质体的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为12 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55 mol·L^-1,愈伤培养天数为10~12 d、预处理措施为黑暗24 h。     

外源赤霉素和褪黑素对三种胁迫下白三叶种子萌发、幼苗生长及生理的影响

为探究外源赤霉素(GA)和褪黑素(MT)对盐、碱和干旱胁迫下白三叶(Trifolium repens)种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶的影响,本试验以白三叶‘瑞文德’为试验材料,设置不同浓度(5,10,20,50 mg·L^-1)GA和(1,2,5,12 mg·L^-1)MT的处理,测定了3种胁迫下种子萌发、幼苗生长及生理指标。GA和MT可有效缓解盐、碱和干旱胁迫对白三叶种子萌发及幼苗生长的抑制作用,且随着外源物质浓度的升高,各指标呈先升后降的趋势。其中,20 mg·L^-1 GA显著促进了盐胁迫下白三叶的种子萌发;5 mg·L^-1 MT显著增加了干旱胁迫下白三叶的胚根长和鲜重;20 mg·L^-1 GA显著提高了碱胁迫下白三叶的SOD、POD和CAT活性。通过隶属函数分析得出20 mg·L^-1 GA浸种缓解盐和碱胁迫效果最佳,5 mg·L^-1 MT浸种缓解干旱胁迫效果最佳。因此,在盐、碱和干旱胁迫条件下,使用20 mg·L^-1     

体外成熟液中添加PAF对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达的影响

旨在探讨体外成熟（IVM）液中添加血小板活化因子（PAF）对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达影响。本试验将牦牛1 025个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）分为4组,分别在含不同浓度PAF（0、10^-8、10^-7和10^-6mol·L^-1）的IVM液中成熟后,与奶牛精子体外受精（IVF）和体外培养（IVC）,比较分析各组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率以及COCs和胚胎中抗凋亡（BCL-2）、促凋亡（BAX）、表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）、转录因子（OCT-4和NANOG）和c-fos等基因的表达量差异。结果表明,IVM液中PAF浓度为10^-7mol·L^-1组的卵母细胞成熟率（（92.16±0.19）%）、卵裂率（（77.20±0.85）%）和囊胚率（（46.71±0.68）%）显著高于其他组（P<0.05）。qPCR结果显示,在该组成熟的COCs中BCL-2、EGF、EGFR、c-fos表达量显著上调（P<0.05）,而促凋亡基因BAX表达量显著下调（P<0.05）,囊胚中EGF、EGFR、OCT-4基因表达量显著上调（P<0.05）。各组间2-、4-、8-细胞、桑椹胚和囊胚中BCL-2、BAX和NANOG表达量差异不显著,但桑椹胚和囊胚中BCL-2表达量均明显下调,而BAX表达量均明显上调。综上所述,IVM液中适宜浓度PAF（10^-7mol·L^-1）可以促进牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育,调控细胞凋亡和增殖相关基因的表达。     

青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

为建立青绿苔草高效的再生体系,本研究以青绿苔草的种子为外植体,探究不同植物激素配比对愈伤组织诱导、愈伤分化和生根的影响。结果表明:MS+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D为诱导愈伤的最佳培养基,诱导率可以达到68.3%,愈伤表现为松散的黄色颗粒;MS+1.0 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA为最佳分化培养基,分化率为93.8%,不定芽数量达到40个,长势良好;不定芽在1/2 MS培养基中生根效果最好,其根长、株高和生根数量均显著高于其他处理。本研究建立了高效的青绿苔草再生体系,为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定了基础。     

NaCl处理对4种牧草植物种子萌发的影响

为探究草木樨（Melilotus suaveolens Ledeb.）、沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）、沙米（Agriophyllum squarrosum（Linn.）Moq.）、蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）4种牧草种子在不同浓度NaCl处理下的萌发情况,本试验采用50 mmol·L^-1,100 mmol·L^-1,150 mmol·L^-1,200 mmol·L^-1,300 mmol·L^-15种NaCl浓度处理这4种牧草种子,测定其种子的发芽率、发芽指数等。结果表明：低浓度NaCl（50 mmol·L^-1和100 mmol·L^-1）处理对草木樨和沙打旺种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数的影响不显著,但对沙米和蒙古冰草种子的发芽有显著抑制作用;当NaCl浓度达到150 mmol·L^-1和300 mmol·L^-1时,沙米和蒙古冰草种子均不能发芽;4种牧草种子对NaCl的耐受程度由强到弱的顺序为：草木樨、沙打旺、蒙古冰草、沙米。     

SA,ETH和IAA处理对破除赖草种子休眠的影响

为研究破除赖草（Leymus secalinus）种子休眠的方法,采用浓度为0.01~0.17 mmol·L^-1水杨酸（Salicylic acid,SA）、200~600 μL·L^-1乙烯利（Ethephon,ETH）、20~60 mg·L^-1吲哚乙酸（Indoleacetic acid,IAA）分别对赖草种子浸种处理12 h,24 h,36 h,通过测定分析4个种子发芽指标,探究这3种物质对破除赖草种子休眠的影响,为赖草种子的人工繁殖提供理论依据。结果表明：适宜浓度的SA,ETH和IAA浸种处理均能有效打破赖草种子休眠,用0.05 mmol·L^-1 SA浸种12 h后种子发芽率最高为64%,是对照的2倍;用20 mg·L^-1 IAA浸种24 h时,种子发芽势达到最大为33%,高于SA,ETH处理;其次用50 mg·L^-1 IAA浸种36 h和200 μL·L^-1 ETH浸种12 h时,种子发芽率分别为51%和48%,均显著高于对照。然而与IAA处理不同,高浓度的SA,ETH会抑制种子发芽。因此,浓度为0.05 mmol·L^-1 SA浸种处理12 h破除赖草种子休眠的效果最佳。     

瑞香狼毒根提取物对荞麦桃蚜的毒力及其作用机制

蚜虫是荞麦(Fagopyrum esculentumMoench)花期的主要害虫,对荞麦产量影响很大,本论文研究了不同浓度瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)根提取物对荞麦桃蚜的杀虫活性以及对其体内2种靶标酶和3种解毒酶活性的影响。结果表明：瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜有较强的毒杀作用,24 h对桃蚜的致死中浓度LC₅₀为1 243.7 mg·L^-1。桃蚜经提取物处理24 h后,其体内乙酰胆碱酯酶活性受到抑制,最高抑制率为21.7%;腺苷三磷酸酶活性升高,Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活性在提取物浓度为4 000 mg·L^-1时最大,显著高于未处理桃蚜两种酶活性,分别是未处理的12.0和1.8倍。瑞香狼毒根提取物提高了桃蚜体内解毒酶——谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P₄₅₀的活性,降低了羧酸酯酶活性。综上,瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜有很好的毒杀作用,提取物可影响桃蚜的靶标酶和解毒酶活性,干扰其正常生理生化活动。     

PGD2/DP1途径对细菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达的影响

为了研究前列腺素D₂（prostaglandin D₂,PGD₂）/DP₁受体途径对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染奶牛子宫内膜组织中炎症介质HMGB-1和PAFR的表达及对组织损伤程度的影响,试验以体外培养奶牛子宫内膜组织为研究对象,应用1×10^-6 mol/L DP₁受体激动剂（BW-245C和15d-PGJ2）和等量（1×10⁶ CFU/mL）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织,采用实时荧光定量PCR、免疫组化和HE染色法检测奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR的表达并评价组织损伤情况。结果显示,与空白对照组相比,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达量显著升高（P<0.05）,而DP₁受体激动剂与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共处理奶牛子宫内膜组织中DP₁受体激动剂显著抑制奶牛子宫组织中HMGB-1和PAFR的表达（P<0.05）。HE染色结果显示,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织上皮细胞和腺上皮细胞完全脱落、坏死、崩解;而DP₁受体激动剂、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织中,DP₁受体激动剂的加入显著减轻奶牛子宫内膜组织的损伤程度（P<0.05）。免疫组化染色法结果与以上两种方法结果一致。结果表明,PGD₂能够抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织中损伤相关因子HMGB-1、PAFR的表达,减轻组织损伤程度,这一作用可能是由DP₁受体所介导的。     

热带人工草地群落结构研究初探

研究4年生热带人工草地放牧与不放牧对群落结构的影响,结果表明:以热研2号柱花草和珊状臂形草为优势草种的人工草地,其中对照区(不放牧)干草产量8096kg/hm²,极显著高于天然草地116.04%,放牧区6324.5kg/hm²,显著高于天然草地68.77%;其产草量呈动态变化,以10月最高;植被群落呈垂直空间层状分布,产草量多集中在11～40cm草层;在放牧区热研2号柱花草的频度和产草量减少,珊状臂形草和有钩柱花草增加,草种分布均匀,结构合理,向进展方向演替。     

双氢睾酮通过调控孕酮、雌二醇和细胞凋亡参与绵羊子宫功能

旨在探究双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）是否通过调节孕酮（progesterone,P₄）、雌二醇（oestrogen,E₂）和细胞凋亡参与影响绵羊子宫功能,以揭示其在绵羊生殖生理中的潜在作用。本试验以1.5岁左右的雌性小尾寒羊为试验动物,检测卵泡期、黄体期和妊娠期子宫中DHT合成酶和雄激素受体（androgen receptor,AR）的表达变化。随后,体外培养绵羊子宫内膜上皮细胞,并用DHT （10^-10~10^-7 mol·L^-1）和AR拮抗剂氟他胺（Flu,10^-8 mol·L^-1）处理（n=3）。通过酶联免疫吸附试验、细胞免疫荧光、蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测P₄和E₂水平、合成酶和受体表达。此外,还检测经DHT和Flu处理后,绵羊子宫内膜上皮细胞中凋亡因子Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma protein 2,Bcl-2）、半胱天冬酶3（caspase 3,CASP3）和活化半胱天冬酶3（active-caspase 3,Act-CASP3）的表达变化。结果表明,绵羊子宫不同时期DHT的合成和AR的表达存在差异,妊娠期子宫DHT合成及AR表达显著低于卵泡期和黄体期（P<0.05）。10^-10~10^-7 mol·L^-1DHT处理后,P₄合成酶表达显著上调（P<0.05）,在10^-8~10^-7 mol·L^-1 DHT时P₄合成显著增加（P<0.05）,在10^-10~10^-8 mol·L^-1 DHT时孕酮受体蛋白表达显著增加（P<0.05）,但10^-7mol·L^-1 DHT时孕酮受体蛋白表达显著下降（P<0.05）;在10^-8~10^-7 mol·L^-1 DHT时E₂相关合成酶显著减少,并且E₂水平显著下降（P<0.05）,在10^-9和10^-7 mol L^-1 DHT时E₂受体ERα蛋白显著下调（P<0.05）,在10^-10~10^-7 mol·L^-1 DHT时ERβ和GPER显著增加（P<0.05）。经Flu处理后部分解除DHT对P₄和E₂的调控。此外,10^-10~10^-7 mol·L^-1 DHT显著促进子宫内膜上皮细胞凋亡（P<0.05）。本研究证实DHT至少部分通过AR调节P₄和E₂合成及受体表达,影响细胞凋亡,参与调节子宫功能,这为进一步阐明雄激素参与调节子宫功能提供了新的基础和相关数据。