水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测

 从T-DNA水稻标签系中发现1个标签系中出现了小粒矮(sgd)突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究,对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件,且T3代发现目标突变性状分离系中,另一个非目标插入事件已经纯合,故特异PCR检测不能确认小粒矮突变性状与T-NA插入共分离。但通过TAIL-CR方法,获得了插入点侧翼的水稻基因组序列,并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。     

转座子标签法及其在大豆功能基因组研究中的应用前景

转座子标签法是克隆未知基因的有效方法之一.本文介绍了转座子标签法的基本原理、步骤、方法及其在植物基因克隆中的应用情况,并对该方法在大豆突变体库构建和功能基因组研究中的应用前景进行了讨论.     

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

Rapid Generation of Selectable Marker-Free Transgenic Rice with Three Target Genes by Co-Transformation and Anther Culture

The ‘double T-DNA’ binary vector p13HSR which harbored two independent T-DNAs, containing hygromycin phosphotransferase gene (hpt) in one T-DNA region and three target genes (hLF, SB401, RZ10) in another T-DNA region, was used to generate selectable marker-free transgenic rice by Agrobacterium-mediated transformation. The regenerated plants with both the three target genes and the selectable marker gene hpt were selected for anther culture. RT-PCR analysis indicated that target genes were inserted in rice genomic DNA and successfully transcribed. It took only one year to obtain double haploid selectable marker-free transgenic plants containing the three target genes with co-transformation followed by anther culture technique, and the efficiency was 12.2%. It was also noted that one or two target genes derived from the binary vector were lost in some transgenic rice plants.     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

Inverse PCR法快速测定转基因马铃薯中T-DNA的拷贝数

利用Inverse PCR技术分析原生质体途径导入PLRV-CP基因的马铃薯转基因后代T-DNA拷贝数,结果与Southern Blot相同。经RT-PCR分析,低拷贝数的转基因后代显阳性反应,多拷贝数的显阴性反应,说明T-DNA多拷贝数影响外源基因的表达。Inverse PCR技术能为早期快速准确预测转基因植株中外源基因的T-DNA拷贝数,排除多拷贝重复串联序列诱导的外源基因沉默植株,为获得稳定表达的转基因株系提供有效方法。     

拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定

β-罗勒烯（β-Ocimene）是一种单萜挥发性有机物,亦是一种重要的植物通讯信号分子。为了进一步研究β-罗勒烯的作用机理,需要获得β-罗勒烯合成酶基因表达沉默的实验材料。根据TAIR网站上公布的β-罗勒烯合成酶信息,从美国拟南芥生物资源中心购买该基因的T-DNA插入突变体材料,运用双引物法对这些突变体进行了T-DNA插入位点的鉴定,获得8株稳定遗传的纯合突变体,该结果为深入研究β-罗勒烯的功能奠定了良好基础。     

可去除选择标记的转CpTI基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI连接,插入根癌农杆菌双T-DNA质粒,构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg;另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体,用以转化农杆菌菌株,再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选,用特异PCR扩增和Southern杂交检测,从分化再生的T0代植株中,鉴定出7个转化CpTI基因的阳性植株。目前,正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定,培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。     

Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT-PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(Δ6-dsa).DNA序列测定结果表明,Δ6-dsa全长1 347bp编码448个氨基酸.Δ6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析,结果表明,Δ6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同.Δ6-dsa克隆进T-easy Vector后形成质粒pGΔ6-DSA.把质粒pGΔ6-DSA上的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T-DNA和35S启动子的质粒pGIN22中,形成含有目的基因的表达载体pGIN23.把表达载体pGIN23与另一个含有T-DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体PLPN28进行亚克隆,使得筛选标记基因和Δ6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T-DNA内,构建成共转化表达载体pLIN61.     

一种适于PCR扩增的荞麦DNA大量提取及纯化方法

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以荞麦叶片为材料,针对荞麦叶片中黄酮含量高,提取荞麦基因组DNA时采用改良的CTAB方法,该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和检测,获得的DNA条带较亮、无RNA、无拖尾现象;经分光光度计检测获得数据证明酚类、蛋白质较少。利用ISSR引物对提取的荞麦基因组DNA进行PCR检测,能获得清晰稳定的条带,说明该方法提取的荞麦基因组DNA能满足PCR反应的需要。     

玉米Mutator转座子

Mutator转座子因其拷贝数高、正向突变频率高、倾向于插入低拷贝的DNA序列等独特的遗传特性,已成为基因组学研究中重要的诱变剂之一。本文对Mutator转座子的发现、Mutator家族的分类、Mutator转座子的特性、Mutator元件的表观调控、Mutator转座子标签在植物基因组学研究中的应用作了综述。对Mutator系统的研究进行了展望。     

SSR标记在小麦遗传育种中的应用研究进展

SSR(simple sequence repeat)标记是建立在PCR基础上的一种新型DNA分子标记。由于SSR在普通小麦中多态性丰富,随机分布于小麦的整个基因组中,多数表现为共显性,所以它是进行小麦遗传研究的理想工具。本文就SSR标记在构建小麦遗传连锁图谱、标记和定位目的基因、鉴定和标记染色体片段、鉴定品种、遗传多样性分析和标记辅助选择等方面的研究进展进行了综述。     

转座子标签法克隆水稻基因前景

转座子标签法克隆基因是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术。介绍了转座子标签技术克隆基因的基本原理及研究进展,并对转座子标签技术在水稻基因克隆上的应用进行了讨论分析。     

玉米Mutator转座子

Mutator转座子因其拷贝数高、正向突变频率高、倾向于插入低拷贝的DNA序列等独特的遗传特性，已成为基因组学研究中重要的诱变剂之一。本文对Mutator转座子的发现、Mutator家族的分类、Mutator转座子的特性、Mutator元件的表观调控、Mutator转座子标签在植物基因组学研究中的应用作了综述。对Mutator系统的研究进行了展望。     

影响小麦RAPD稳定性的试验技术研究

随着PCR和PAPD技术在生物学业领域的广泛应用，人们在实验中遇到的问题也越来越多，其中PAPD的可重复性差是最主要的一个问题，也是该技术最难克服的特点。作者在利用RAPD技术标记进行小麦的抗病毒基因研究中，对影响扩增结果的模板、底物、引物和扩增程序等进行了实验探索，结果表明：模板的浓度、dNRP浓度、引物浓度及反应程序均对RAPD扩增结果有明显影响。     

烟草遗传标记研究进展

遗传标记主要包括形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和分子标记。分别对这4种遗传标记技术在烟草上的应用进展进行了综述,并对当前烟草领域遗传标记研究存在的问题及对策进行了分析和探讨。遗传标记将为烟草品种鉴定、亲缘关系、连锁图谱构建、分子标记辅助育种等方面的研究提供有效的方法和手段,有着广阔的前景。     

分子标记技术在玉米基因定位和辅助选择中的应用

本文评述了近一、二十年利用分子标记技术研究玉米重要基因的作图和定位及分子标记辅助选择等,并提出了我国在该领域的发展策略。     

利用遗传突变基因改良特用玉米Ⅴ.甜玉米胚乳突变基因的效应与利用

简要说明甜玉米突变基因由来以及研究近况.甜玉米在碳水化合物中形成的隐性突变基因占有相当大的比例,其种源丰富,已育成多个品种.在育种技术方面,着重介绍新方法--转座子育种技术。