水稻OsHDT703基因的可变剪接体分析

为了克隆水稻HD2蛋白基因OsHDT703,并分析其存在的可变剪接体。利用生物信息学分析,结合RT-PCR、TA克隆和测序等方法,鉴定1个水稻中全新的HD2蛋白成员(OsHDT703)。结构域分析发现,在其N端含有HD2家族的NPL保守结构域。选取来源于7个物种的16个HD2蛋白,构建蛋白进化树,结果发现,OsHDT703蛋白与OsHDT702蛋白处于同一分支; OsHDT701则处于另一分支,说明水稻中HD2家族蛋白可能存在功能分化。根据预测的不同剪接体设计4对特异性引物,以粳稻中花11叶片和幼穗c DNA为模板,利用RT-PCR扩增,结合TA克隆,通过测序比对,成功鉴定到4种不同可变剪接体序列。由于3号(OsHDT703. 3)和4号(OsHDT703. 4)剪接体的CDS序列完全相同,所以证明OsHDT703至少存在4种不同可变剪接体。综上所述,鉴定到水稻中1个全新的HD2蛋白,命名为OsHDT703,并且鉴定出至少4种存在可变剪接体,为后续深入研究该基因生物学功能奠定基础。     

玉米冷响应基因ZmCyp40克隆及其遗传转化

从抗冷玉米自交系W9816中克隆冷响应基因ZmCyp40,对该基因进行序列分析,发现其编码389个氨基酸,与高粱中的同源基因亲缘关系较近。qRT-PCR分析玉米自交系W9816低温(4℃)处理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后其根、茎、叶中基因ZmCyp40表达情况,发现ZmCyp40在玉米不同部位冷响应表达趋势不同,但均受冷诱导表达。构建ZmCyp40过表达载体,采用农杆菌介导法转化玉米优良自交系Y423的幼胚和愈伤。PCR检测转化植株,ZmCyp40阳性植株率为5.9%。qRT-PCR分析发现部分阳性植株中ZmCyp40基因的表达量有极显著的升高,可用于进一步的功能分析及玉米抗冷性状的遗传改良。     

番茄SlETR6基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的组织表达情况及对其在高盐、高温(40℃)、低温(4℃)、干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,SlETR6基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2 265 bp,编码754个氨基酸,蛋白质分子质量为85. 05 ku,等电点为7. 28,与马铃薯St ETR-like蛋白的同源性最高;启动子分析显示,SlETR6基因含有热胁迫、干旱胁迫、低氧胁迫、光响应、乙烯、水杨酸及赤霉素应答等相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,SlETR6在番茄不同组织中均有表达,且在花和转色期果实中有显著高表达。高盐胁迫6 h后,SlETR6基因呈现上调表达,12 h后达到峰值,而后回复正常表达水平;高温胁迫后,SlETR6基因表达量有明显的上升趋势;干旱胁迫早期SlETR6基因应答强烈,在胁迫处理1 h后表达量达到峰值。因此,推测SlETR6基因可能在番茄适应高盐、高温、干旱等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与番茄生长发育过程中的逆境调控。为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

拟南芥肌醇半乳糖苷酶AtGolS2基因在非生物胁迫应答中的功能分析

土壤盐碱化是导致作物减产的主要因素之一,鉴定关键耐盐碱基因对于利用分子育种手段培育耐盐碱作物新品种具有重要意义。本研究通过Na HCO3处理筛选,获得了苏打盐碱敏感的拟南芥突变体atgols2。生物信息学分析发现AtGolS2编码肌醇半乳糖苷酶,是糖基转移酶家族A超家族中一员。SMART分析At GolS2蛋白互作网络,发现其互作蛋白与脂类代谢、半乳糖生物合成、棉子糖生物合成相关,且参与非生物胁迫应答。转录表达数据分析发现AtGolS2表达显著响应盐、高渗、干旱和ABA胁迫。利用三引物法PCR鉴定atgols2为T-DNA插入纯合突变体,并进一步分析了atgols2在高盐、高渗和ABA处理下的表型,结果表明AtGolS2基因缺失降低了对高盐、高渗和ABA胁迫的耐性。本研究初步明确了AtGolS2基因正调控苏打盐碱、高盐、高渗和ABA应答过程,为进一步阐明GolS家族基因耐逆功能和作用机制提供一定基础。     

ZmGDH基因克隆及在玉米中的遗传转化

本研究从抗冷玉米自交系W9816中克隆了Zm GDH基因。分析发现该基因与其他植物中的谷氨酸脱氢酶基因(GDH)基因具有较高的同源性,其中与高粱同源性达到95.38%。对抗冷玉米自交系W9816进行4℃冷处理,分别在处理后0、6 h、12 h、24 h和48 h取材,采用q RT-PCR方法测定不同冷处理时间下Zm GDH在根、茎、叶中的表达情况,结果发现在不同组织中Zm GDH基因对不同时长的冷诱导响应存在显著的差异。另外通过农杆菌介导法对玉米骨干自交系Y423愈伤组织进行了Zm GDH基因的转化,PCR检测鉴定阳性转化植株,最终统计阳性转化率为4.3%。对T0代阳性植株进行q RT-PCR表达量分析,证明了阳性转化植株中Zm GDH基因的高表达。本研究所获得的Zm GDH转基因材料可用于Zm GDH基因的生物功能分析及抗冷转基因玉米新种质创制。     

水稻干扰素相关发育调节因子的生物信息学分析

干扰素相关发育调节因子(interferon-related developmental regulator factor, IFRD)在动物中有较深入研究,参与动物细胞发育和分化及多种疾病的发生,但是在植物中研究较少。为了挖掘植物IFRD基因的功能,本研究对禾本科模式作物水稻IFRD基因家族成员进行了系统的生物信息学分析。本研究鉴定得到5个水稻IFRD基因家族成员,分布在4条染色体上,根据进化树把它们分为2个亚家族,不同亚家族成员具有不同的基因组结构、蛋白质保守基序和表达模式。高温、盐胁迫处理后的转录组测序分析结果显示,该基因家族成员(OsIFRD3, OsIFRD4)对逆境的响应变化差异显著;蛋白质相互作用分析结果显示水稻IFRDs可能与mRNA可变剪接因子、甲硫氨酰t RNA合成酶、rRNA加工蛋白相互作用;启动子分析显示水稻IFRD启动子具有非生物胁迫和植物激素响应元件。综上表明水稻IFRD基因家族可能通过调控m RNA可变剪接和蛋白质的合成参与高温、盐胁迫逆境响应途径。本研究为深入解析水稻IFRD基因功能提供了重要信息。     

黄牛睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接体的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法从黄牛睾丸组织中克隆睾丸特异乳酸脱氢酶.C(LDH-C)基因的cDNA序列,结果发现2种Ldhc剪接体,根据Ldhc基因在进化上的保守性,参照普通牛Ldhc基因结构分析了黄牛Ldhc基因的选择性剪接体的结构,结果显示,剪接体存在外显子缺失:其中剪接体1缺失第7个外显子,剪接体2缺失第4和第7两个外显子.因为LDH-CA酶的NAD+结合结构域由Ldhc的外显子2-4编码,酶的活性中心由外显子4编码.所以剪接体1包含完整酶的NAD+结合结构域和酶的活性中心,剪接体2失去了大部分NAD+结合结构域和酶的活性中心.对黄牛睾丸组织和精子LDH同工酶的电泳分析未检测到潜在的Ldhc剪接体的表达,推测睾丸组织Ldhc选择性剪接的功能是调控该基因在睾丸中表达的方式之一.     

葡萄NBS-LRR基因家族的鉴定与表达分析

为了克隆葡萄中NBS-LRR基因家族成员,并对其功能进行鉴定。以‘黑比诺’葡萄试管苗为试验材料,采用RT-PCR克隆葡萄NBS-LRR基因家族并进行生物信息学分析,结合芯片表达数据及RT-qPCR技术分析了该家族基因在非生物胁迫下的表达情况。结果表明,从葡萄中克隆得到41个NBS-LRR成员,对其编码的蛋白分析表明,分子量在56 362.76～177 974.27 Da之间,等电点(pI)介于5.31～9.54,有11个成员分布在未知染色体上,其他成员分别定位在8条染色体上;二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。RT-qPCR结果显示,VvNBS-LRR08在50μmol/L JA和400 mmol/L NaCl处理24 h后表达水平达到对照的760倍以上,VvNBS-LRR03和VvNBS-LRR28在400 mmol/L NaCl处理后表达水平分别为对照的3.5和1.3倍,10%PEG处理后VvNBS-LRR03和对照无显著差异,而VvNBS-LRR28表达水平下调显著;VvNBS-LRR05和VvNBS-LRR40在10%PEG处理24 h表达水平分别为对照的1.3和3.6倍,Vv...     

GmSbh1在大豆种子发育、响应高温高湿和激素诱导中的表达分析

GmSbh1(L13663)是大豆中被克隆的第一个同源异型盒(homeobox,HB)基因。该类基因在调控植物生长发育、响应逆境胁迫和激素诱导等方面发挥重要作用。本研究采用q RT-PCR技术,分析GmSbh1基因在大豆不同组织器官、叶片与种子发育、种子萌发以及响应高温高湿胁迫和激素诱导中的表达模式。结果表明,GmSbh1基因在大豆种子中的表达量高于幼苗,子叶和胚中的表达高于种皮,幼苗下胚轴、真叶和根中的表达量很低。大豆种子发育成熟过程中GmSbh1表达量逐渐上升,生理成熟期(R7期)表达量显著增加,完熟期(R8期)表达量最高;种子萌发过程中GmSbh1表达量呈先升后降趋势,吸胀24~48 h表达量上升,随后下降;随着大豆叶片的发育和衰老,GmSbh1表达呈先升后降趋势,功能叶期表达量最高。高温高湿胁迫后大豆种子中的GmSbh1表达量上升,胁迫48 h后上升的幅度显著增大;与对照相比,不抗田间劣变品种宁镇1号显著上调表达,抗性品种湘豆3号下调表达。100μmol/L ABA、100μmol/L Me JA、100μmol/L GA3和20μmol/L IAA处理宁镇1号1 h后,GmSbh1的表达量显著升高,随着处里时间的延长,表达量降低;同样浓度的几种激素处里湘豆3号后,GmSbh1表达变化的规律不明显。以上结果表明,GmSbh1基因可能参与大豆种子与叶片的发育,响应高温高湿胁迫和激素诱导。     

β-氨基丁酸早期诱导表达基因StWRKY5参与马铃薯晚疫病抗性

β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导能够增强马铃薯对晚疫病的抗性。本研究从马铃薯中克隆了一个WRKY转录因子家族的基因St WRKY5。c DNA-AFLP表达谱研究表明,BABA(2 mmol/L)处理马铃薯6 h后该基因明显上调表达,晚疫病菌(Phytophthora infestans)接种16 h后上调表达。半定量RT-PCR检测表明水杨酸SA(10μmol/L)处理马铃薯离体叶片4 h后该基因上调表达,茉莉酸甲酯Me JA(50μmol/L)诱导12 h后开始表达,机械伤害处理24 h后,该基因表达也会增强,表明该基因参与多种生物和非生物因子的胁迫反应。通过稳定转化获得了超量表达St WRKY5的转基因马铃薯株系。采用离体叶片接种鉴定方法对转基因马铃薯株系晚疫病抗性进行了鉴定,研究结果显示接种4 d后超量表达转基因株系其病斑面积均显著小于对照,表明在马铃薯中超量表达St WRKY5提高了晚疫病抗性。     

GsERF6基因过表达对水稻耐盐碱性的影响

乙烯响应因子(ERF)是植物特有的一类转录因子,在响应非生物胁迫中具有重要作用。本研究通过生物信息学发现,野生大豆耐盐碱ERF转录因子GsERF6与水稻ERF同源蛋白的氨基酸序列相似性很高,均包含1个高度保守的AP2结构域。为探究GsERF6基因在水稻耐盐碱应答中的作用,通过遗传转化、PCR和半定量RT-PCR鉴定,获得了2个纯合的GsERF6过表达转基因水稻株系。表型鉴定表明, 200 mmol L^–1 NaHCO3处理下GsERF6转基因水稻的存活率、相对含水量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性、可溶性糖和脯氨酸含量均显著高于对照,活性氧积累则反之。实时荧光定量PCR分析表明, 40 mmol L^–1 NaHCO3处理6 h后渗透调节基因OsP5CS2和OsLEA14在GsERF6转基因水稻中的表达量显著高于对照。本研究表明,水稻中GsERF6的过表达可通过提高ROS清除水平、渗透调节能力及胁迫应答基因的表达来提高其耐盐碱性。     

河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析

为了鉴定河北杨中的脱水素基因并研究其在逆境胁迫中的表达规律,以初步分析脱水素基因在河北杨逆境胁迫中的调控功能,在实验室前期工作的基础上设计引物,通过PCR方法扩增河北杨cDNA文库获取脱水素基因,并通过半定量RT-PCR方法研究其在逆境中的表达情况。结果表明,河北杨脱水素全长基因856 bp,共编码227个氨基酸。同源性分析表明,河北杨中的脱水素基因与已知的其他杨树脱水素高度同源,因此将该基因定名为Phdhn1。半定量RT-PCR结果表明在干旱、低温、高温、高盐及ABA溶液不同时间段(0、0.5、1、2、5、10、24 h)的胁迫下,河北杨Phdhn1在干旱、ABA以及低温胁迫下均出现表达差异。该研究初步阐述了Phdhn1的逆境表达模式,说明了Phdhn1在河北杨逆境胁迫中起到的重要作用。     

广藿香(Pogostemon cablin)PatWRKY40和PatWRKY53的基因克隆与表达分析

WRKY转录因子在转录调控、次生代谢调控和生长发育中起关键作用。为了了解WRKY转录因子在广藿香中的调控模式,本研究从广藿香转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的PatWRKY40和PatWRKY53基因,利用PCR技术克隆得到基因的全长编码区。对PatWRKY40和PatWRKY53基因进行生物信息学分析。结果表明:PatWRKY40和PatWRKY53基因全长分别为1 074 bp和1 150 bp,编码213个和340个氨基残基,蛋白分子量为33.31 kD和37.79 kD,都属于亲水蛋白,预测其均定位于细胞核。此外,PatWRKY40和PatWRKY53分别属于Ⅱ类和Ⅲ类WRKY转录因子,并具有不同的蛋白结构,系统发育树分析这2个基因在不同分枝上。利用RT-PCR对PatWRKY40和PatWRKY53的表达模式进行分析,发现PatWRKY40具有组织表达差异(叶花茎),PatWRKY40和PatWRKY53在MeJA诱导6 h后表达量被显著上调了1.6倍和3.2倍。表明PatWRKY40和PatWRKY53明显受到JA诱导,可能介导JA信号通路参与广藿香的发育及代谢调控。本研究首次克隆广藿香的WRKY类转录因子并解析其表达模式,为后续PatWRKY40和PatWRKY53的功能鉴定及对其调控网络研究提供理论参考。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析

通过生物信息学及RT-qPCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)的方法对水稻OsUCH-L5基因进行探究。生物信息学预测结果表明,该基因全长837 bp,编码278个氨基酸;OsUCH-L 5蛋白的相对分子质量为31.64 kDa,等电点为5.66,为亲水性蛋白,具备Peptidase_C 12及UCH_C结构域;系统进化树表明,与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)BdUCH-L 5亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,OsUCH-L5基因具有组织特异性,在根中表达最佳;在不同干旱脱落酸(200μmol·L^-1)、D-甘露醇(1 mmol·L^-1)及氯化钠盐胁迫(250 mmol·L^-1)处理下,基因表达量存在显著差异,并分别在0.5 h、6 h、12 h时表达水平最佳;在油菜素内酯(200μmol·L^-1)处理下,在3 h时OsUCH-L5基因表达量达到最大值;同时,OsUCH-L5基因还受4℃低温和40℃高温的诱导表达,即分别在3 h和1 h时基因表达量达到最大值。因此该研究为进一步探索水稻UCH家族在调节水稻抗性、信号转导、营养以及盐分胁迫调控等过程中的作用提供基础。     

外源钙离子对高温胁迫下草莓幼苗影响的转录组分析

为探究添加外源钙离子后高温胁迫下草莓幼苗叶片的基因表达变化情况,本试验以‘红颜’草莓幼苗为材料,设置4个试验处理,分别为对照(昼/夜25℃/17℃16 h/8 h)每株喷施20 mL蒸馏水、对照每株喷施20mL的8mmol/L CaCl₂溶液、高温(昼/夜42℃/34℃16h/8h)每株喷施20mL蒸馏水、高温每株喷施20 mL的8 mmol/L CaCl₂溶液,在高温胁迫第3天时取叶片进行转录组测序和生物信息学分析。结果表明：与高温喷施蒸馏水处理组相比,高温喷施外源钙离子处理组发生差异表达的基因共有2 452个,其中1 504个上调表达,948个下调表达;GO富集分析显示在细胞组成中,差异基因显著富集在细胞、细胞部分和细胞器;在分子功能中显著富集的条目是结合、催化活性、结构分子活性;显著富集的生物过程为代谢过程、细胞过程、刺激应答等;KEGG富集分析表明显著富集的代谢通路有植物与病原体的相互作用和MAPK植物信号传导途径-植物和植物激素信号转导等,进一步分析发现添加外源钙离子会使一些编码钙离子感受蛋白、WRKY转录因子、MYB转录因子、热激...     

高温胁迫下杜鹃差异表达基因的cDNA-SCoT分析

杜鹃花为高山植物,大多不耐高温,严重制约了杜鹃花的迁地保护与园林应用,故有必要探讨杜鹃花属植物在高温逆境下的耐热机理。本研究以2年生的‘胭脂蜜’(Rododendron'Yanzhimi')和‘江南春早’(R.'Jiangnanchunzao')为材料,进行高温(42℃/30℃)处理,在处理后2、4、8、12及24 h后取样,构建高温处理及对照的RNA混合池,利用目标起始密码子多态性(c DNA-SCo T)进行差异分析。结果表明,40条引物能扩增出110多条条带,筛选出20条差异明显的条带,测序拼接后获得16条高质量的序列。通过生物信息学分析,发现了13个差异表达的基因,它们与逆境防御反应、植物代谢、基因转录和细胞结构合成等有关。     

吉富罗非鱼感染无乳链球菌后肝脏组织多肽差异表达研究

为研究吉富罗非鱼感染无乳链球菌后肝脏组织多肽表达变化,采用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)扫描了吉富罗非鱼感染无乳链球菌24 h后与未感染的罗非鱼肝脏组织的多肽质谱峰值差异,并对表达差异的多肽峰值进行蛋白质质谱鉴定和功能分类。结果显示:对照组检测到信噪比(s/n)大于50的质谱峰为44个,试验组为52个,发现6个质谱峰(m/z 1 082,1 161,1 196,1 459,1 740,1 877)在感染24 h后与未感染鱼之间的表达差异明显,其中质荷比(m/z)1 196在试验组表达下降,而质荷比(m/z)1 161和1 459则是上升。共鉴定得到19种多肽,其中14个表达上调,4个下调,1个无明显变化。经生物信息学分析,鉴定得到的多肽分别参与了三羧酸循环、DNA拼接和细胞防御3条信号调控通路。选择其中的ATP合成酶6(ATP6)和beta-羟基丁酸脱氢酶(Bhd1)基因进行qRT-PCR验证,发现ATP6基因在感染24 h后的转录水平显著升高,而Bhd1基因的转录水平则是显著降低,与多肽组相对定量的结果相符。研究结果为无乳链球菌病的早期诊断提供了新的参考依据。     

香菇疏水蛋白hyd1基因高温胁迫下表达与生物信息学分析

为了探讨香菇中疏水蛋白hyd1基因在高温胁迫下的变化情况,进而研究提高香菇对高温的耐受性。本研究首先找出香菇中疏水蛋白hyd1基因序列,筛选出耐高温的香菇菌株18N44和高温敏感型的菌株18为研究对象,比较了高温胁迫下疏水蛋白hyd1基因在香菇两菌株中的相对表达量差异,最后对hyd1基因所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。实时荧光定量PCR结果显示,在整个高温胁迫期间(4 h除外),香菇菌株18N44的hyd1基因表达量显著高于18;生物信息学分析结果显示,香菇hyd1基因所编码的蛋白质由127个氨基酸组成,属分泌型蛋白,含多个功能位点,与平菇的亲缘关系较近。hyd1基因高温胁迫下表达与生物信息学分析可为香菇耐高温相关机制的进一步研究提供理论参考。