双重荧光定量PCR杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MON89034

本研究创建一种简单快捷、成本低廉、灵敏准确及可靠性强的高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的快速检测方法。采用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对转基因玉米MON89034品系进行检测,并针对转基因玉米MON89034靶标基因设计高效稳定的引物和探针,使用zSSIIb基因作为内源基因,避免检测出现假阴性,将反应体系及条件优化后,用实时荧光定量PCR仪进行扩增,初步建立转基因玉米MON89034双重实时荧光PCR检测方法,通过对该方法进行特异性和大样本可靠性测试验证,继而创建出一种高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的检测方法。通过建立的双重荧光定量PCR方法对转基因玉米、非转基因玉米和转基因大豆的DNA混合模板检测得出的结果表明,多种作物DNA混合模板可在单根PCR反应管内实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测,并在2 h内完成检测得到准确结果。目前,建立的该双重实时荧光PCR方法可用于多个转基因作物样品间快速筛查,检测快速,结果准确,可满足大多数检测机构日常检测的需求。     

基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测

转基因植物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术并以番茄抗坏血酸过氧化物酶apx(ascorbate peroxidase)基因和光诱导的早期蛋白elip(early light inducible protein)基因为内参开展对12株转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测。研究结果表明:常规番茄使用的内参基因apx在樱桃番茄中可能以多拷贝形式存在;以elip基因为内参检测到转基因植株内整合的拷贝数为0~20不等,其中4株在普通PCR检测中存在假阳性,且80%的转基因植株发生了基因重排现象。     

转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立

【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。     

转基因抗虫保铃棉(Bollgard(R))检测方法研究

运用常规PCR方法和实时荧光PCR方法对转基因抗虫保铃棉外源基因CaMV 35S启动子、NOS终止子、标记基因NPTⅡ和目的基因CryIA(c)进行了检测。建立了快速、准确的抗虫保铃棉籽转基因成分的PCR检测方法。     

转基因抗虫保铃棉(Bollgard~ひ)检测方法研究

运用常规 PCR方法和实时荧光 PCR方法对转基因抗虫保铃棉外源基因 Ca MV 35 S启动子、NOS终止子、标记基因NPT II和目的基因 Cry IA(c)进行了检测。建立了快速、准确的抗虫保铃棉籽转基因成分的 PCR检测方法。     

转基因大豆种子、豆粕定性PCR检测方法的研究与应用

利用定性PCR检测方法,以大豆凝集素基因(Lectin)为内标基因,检测了转基因大豆种子、豆粕中的四个外源基因:35S-CTP基因、Cp4-epsps基因、nos终止子基因、CaMV35S启动子基因,并通过酶切(XmnI)验证试验验证了定性PCR检测结果的准确性,建立了定性PCR检测转基因大豆种子、豆粕的方法,利用市场上抽检到的大豆种子、豆粕样品,进行了实际检测工作.     

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。     

玉米种子生产基地品种转基因成分快速检测的策略

近年来,种子监督管理过程中发现部分地区存在非法繁育转基因作物的现象.为了打击转基因玉米非法繁育的行为,更好地保障农业转基因安全,对玉米种子生产基地的品种进行转基因成分的现场快速检测十分重要.本研究检索已知商业化转基因玉米的外源目的基因信息,构建了转基因玉米常用外源目的基因数据库,建立了玉米品种转基因成分快速检测的策略.研究发现,利用Cry 1 Ac/Ab、CP 4 EPSPS、Pat/Bar3个快速检测试纸组合可完成20个转基因玉米转化事件的现场快速检测.     

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。     

实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异的引物和探针，对玉米中的内源基因Invertase和转基因玉米Mon 810、Event 176中的外源基因进行了定量检测，建立了商业化转基因玉米Mon 810 (YieldGard)和Event 176 (Maximizer)的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度小于0.01％，是国际上设定的转基因最低限量的100倍。     

定量PCR技术检测转基因玉米的研究

以Bt176转基因玉米为材料,通过使用特异性引物和染料,对转基因玉米中外源基因cry1Ab进行了定量检测。研究发现,在优化检测体系的基础上,SYBR荧光染料法定量检测转基因玉米,具有更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%~0.53%。     

转基因玉米NK603基体标准物质研制

转基因安全管理和标识制度的实施需要标准化的检测方法和转基因检测标准物质,转基因标准物质是获得准确、可靠、可比检测结果的保证。目前,转基因玉米NK603已在我国批准进口用作加工原料,其安全监管亟须制备标准物质。本研究将筛选后的转基因玉米NK603杂合种子和对应的非转基因受体种子,按转基因质量分数为60.0mg g^-1、100.0 mg g^-1、1000 mg g^-1 (理论值)的比例配置了3个梯度浓度水平的转基因基体标准物质。利用二重微滴数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)对研制的标准物质进行均匀性与稳定性检测。结果表明:研制的标准物质均匀性良好,可在60℃下运输14 d,稳定性不低于6个月。同时,由8家实验室采用二重ddPCR方法联合测定标准物质NK603转化体与内标基因的拷贝数比值,其标准值及不确定度为:(2.75±0.26)%、(4.68±0.39)%、(51.8±3.7)%。本批标物使用时最小取样量100 mg。可用于转基因食品和饲料...     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

转基因玉米MIR604基体标准物质研制

转基因生物安全监管是生物技术产业健康发展的保障,而转基因检测标准物质是进行转基因监管检测的物质基础,缺少标准物质就难以保证检测数据的准确性、可靠性和可比性。转基因玉米MIR604是我国批准进口用作加工原料的转基因品种,对其安全监管亟须制备标准物质。本项目通过对转基因玉米MIR604种子进行原材料鉴定、研磨、过筛、含水量测定等步骤,制备出转基因玉米MIR604纯品基体标准物质。均匀性检验和稳定性检验结果表明,本批标准物质在瓶内和瓶间均具有良好的均匀性,可在常温下运输1个月,长期稳定性达到6个月,量值稳定。本批标准物质的特性量值为转基因DNA与总DNA的拷贝数比值,由9家实验室采用MIR604/Adh1二重数字PCR联合定值,量值为0.50。充分评估了标准物质定值结果的各个不确定度分量,合成扩展不确定度为0.06 (copy/copy)。本批标准物质规格为1 g瓶–1,使用时最小取样量为100 mg,可用于转基因玉米MIR604的安全监管和定量标识、以及实验室质量控制等领域。     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

植物安全性表达载体的构建策略:以表达水稻反义蜡质基因的载体构建为例

基于转基因作物的安全性考虑,在用于转化的表达载体上除了含有目的基因以及控制该目的基因表达的启动子和终止子外,最好不存在其它有可能存在安全性争议的DNA序列,由此培育的转基因植物可能将更易于被消费者所接受。本研究以pCAMBIA1300载体为基础,基因操作去除pCAMBIA1300质粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒的35S启动子序列,构建了两种只含有水稻蜡质基因启动子引导蜡质基因反义片段的表达载体,p13AWY-1和p13AWY-2。其中p13AWY-1表达载体含有一个由水稻蜡质基因启动子、第一内含子、反义蜡质基因（W axy pro＋intron1＋anti-W axy）的融合基因单元;而p13AWY-2表达载体含有两个正向排列的W axy pro＋intron1＋anti-W axy融合基因单元。我们通过构建水稻反义蜡质基因安全性表达载体,试图为植物安全性表达载体的构建提供一种思路,为今后大规模商业化采用转基因技术改良农作物遗传特性提供安全的转基因方法。