金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953 bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’ 非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

毛竹木质素合成相关基因C4H的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中克隆了C4H基因cDNA全长序列。该基因包含1 506 bp开放读码框,编码502个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中序列进行比对, 结果表明该基因与单子叶植物高粱、水稻和玉米中的C4H基因同源性较高,分别达到88%、88%和87%。经过荧光定量PCR分析,该基因在毛竹不同发育时期和不同组织中表达丰度不同,在冬笋中表达量最高,其次为春笋顶部、中部、叶、3年生茎、根、叶鞘、2年生茎、春笋、1年生茎,而在春笋基部中表达最低。在笋顶部、中部的高水平表达表明本文克隆的C4H基因与发育时期维管组织的细胞壁加厚相关,可以作为调控木质素合成的目标基因用于竹子基因工程改良。     

日本落叶松杂种及亲本 4CL基因的克隆和SNP多态性分析

以日本落叶松(Larix kaempferi)不同杂交组合为材料,依据转录组测序信息,成功获得了11种日本落叶松材料的4 CL基因的编码区序列,该序列长1 537 bp,包含完整ORF片段1 368 bp,编码455个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明,除日本落叶松Larix16×Larix61组合外,Larix82×Larix13、Larix40×Larix10和Larix82×Larix61子代的表达均高于双亲,推测4 CL基因差异表达与落叶松杂种的木质素生物合成有关。进一步采用SNP标记方法和DNAMAN软件对不同日本落叶松杂种和亲本组合的单核苷酸多态性进行分析。共检测到66个SNP多态性位点,表明日本落叶松4CL 具有丰富的遗传多样性。66个SNP变异中,属于三突变1个;转换类型45个,占总变异的68.18%;20个属于颠换类型,占总变异的30.30%,转换:颠换=9:4。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占28.79%和39.39%;颠换类型中A/C、A/T、G/C、G/T分别占4.55%、9.09%、9.09%和7.58%。采用NJ 聚类法对克隆片段的氨基酸序列进行了遗传多样性分析。     

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C₃型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。     

日本落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因 LkCOMT的克隆及单核苷酸多态性分析

依据日本落叶松转录组数据库检测到的咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因ESTs序列设计引物,分离得到一个编码该酶的新基因。其cDNA克隆全长为1 350 bp,包含长度为1 092 bp的开放阅读框,可编码364个氨基酸残基。序列分析显示,所推导的蛋白质氨基酸序列包含COMT基因5个所特有的保守元件,与海岸松PpCOMT的蛋白质氨基酸序列同源性达94%。在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCOMT序列进行了单核苷酸多样性SNPs分析,共检测到92个SNP位点,SNP发生频率为1/17 bp,多样性指数π_T为0.007 80。在这些SNPs中,65个属于转换,27个属于颠换。在外显子区域,共检测到58个SNP位点,其中37个为错义突变,21个为同义突变。研究结果为日本落叶松基因标记辅助育种提供了理论基础。     

黄牡丹花粉生活力测定方法的比较研究

以黄牡丹的新鲜花粉为试材,利用单因子试验比较了液体培养基中蔗糖浓度、硼、钙、镁、钾对黄牡丹花粉萌发的影响,在此基础上进行了正交试验,比较了蔗糖、H₃BO₃及CaCl₂对黄牡丹花粉萌发的影响;通过对醋酸洋红染色法、I-KI染色法和TTC染色法的比较,寻找快速测定黄牡丹花粉生活力的方法。试验结果表明:蔗糖及H₃BO₃对黄牡丹花粉萌发有极显著影响。在pH值为6.0时,蔗糖150 g·L^-1+H₃BO₃30 mg·L^-1+CaCl₂20 mg·L^-1适宜黄牡丹花粉培养,萌发率为68.7%;纯水培养没有造成花粉原生质体破裂,内含物外流,但萌发率极低,仅为3%;200 g·L^-1以上的高浓度蔗糖溶液和300 mg·L^-1以上的高浓度盐溶液会造成原生质体失水萎缩,质壁分离,这两种情况都抑制花粉萌发;TTC染色法测得的花粉活力率为64.9%,是快速测定黄牡丹花粉生活力的最适染色法。     

美洲黑杨PdZFR基因的克隆和分析

根据美洲黑杨PdZFR部分cDNA序列,采用拟基因组文库步行法和RACE克隆了该基因全长cDNA及基因组DNA, 并对该基因的启动子、转录起始位点、内含子分布、剪切方式、编码的氨基酸序列和该基因在染色体上的分布位置进行了分析。组织或器官特异表达分析表明:该基因与植物发育相关。     

牛角瓜5β黄体酮还原酶基因(Cgp5Br)克隆与序列分析

5β黄体酮还原酶是强心苷合成途径中的第一个关键酶,在强心苷合成中起着重要的调控作用。为了研究牛角瓜中强心苷生物合成途径的关键酶基因,本研究依据牛角瓜转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法从牛角瓜中克隆得到关键酶基因p5Br(5β黄体酮还原酶基因)的2个开放阅读框(ORF),分别命名为Cgp5Br1(GeneBank登录号MH094753)和Cgp5Br2(GeneBank登录号MH094754)。序列分析结果表明,Cgp5Br1的序列长1 164bp,编码387个氨基酸,Cgp5Br2的序列长1 158bp,编码385个氨基酸。进化树分析发现,Cgp5Br1和Cgp5Br2在进化上属于旁系同源。qRT-PCR分析表明,Cgp5Br1和Cgp5Br2在牛角瓜的根、茎、叶、花和种子中均有表达。Cgp5Br1在根中相对表达量最高,而Cgp5Br2在根、茎、叶和花中的表达量都相对较高,种子中最低。本研究为今后利用代谢工程提高强心苷含量提供了重要的基因资源。     

梅花花青素苷调控基因PmMYB1的分离及功能分析

【目的】花青素苷是梅花花色形成的重要色素,R2R3-MYB是花青素苷合成调控的关键转录因子。从梅花中分离出1个R2R3-MYB调控因子PmMYB1,通过分析其序列特征并转入烟草进行功能鉴定,为探明梅花花青素苷合成调控机理及今后梅花花色分子育种奠定基础。【方法】根据梅花基因组数据设计引物,采用RT-PCR方法从梅花花瓣中分离PmMYB1基因,利用DNAMAN软件预测氨基酸序列,通过多序列比对和系统进化树构建分析其保守序列并进行功能预测,通过构建表达载体将PmMYB1基因转入烟草,分析转基因烟草的表型及花青素苷含量的变化,并利用实时荧光定量RT-PCR技术测定该基因及烟草内源花青素苷合成通路基因在转基因植株不同器官中的表达量,综合分析以上数据鉴定PmMYB1基因的功能。【结果】从梅花中分离得到全长为729 bp具有完整编码区的PmMYB1基因序列,该序列编码242个氨基酸。序列分析表明该蛋白具有保守的MYB结构域及花青素苷调控MYB蛋白特征基序,并且含有与bHLH转录因子相互作用的保守基序,可能需要bHLH蛋白协同表达共同完成花青素苷的合成调控。多序列比对和进化分析结果显示PmMYB1与其他已鉴定功能的花青素苷调控MYB蛋白有很高的同源性,其中与樱桃李的PcMYB10和欧洲甜樱桃的PaMYB10一致性分别为92%和91%。转基因烟草试验表明过表达PmMYB1基因显著提高了转基因植株花冠中花青素苷的含量(P0.05),使其花冠颜色明显加深,实时荧光定量RT-PCR试验结果表明PmMYB1基因在转基因植株花中表达量高于叶中,过表达PmMYB1基因明显上调了烟草花中7个内源花青素苷合成通路结构基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT及2个调控基因NtAn1a和NtAn1b的表达量。【结论】在烟草中过表达PmMYB1基因能够显著上调转基因植株花中内源花青素苷合成通路结构基因和调控基因的表达,从而促进了其花中花青素苷的积累并导致花色加深,表明该基因在花青素苷合成过程中起重要调控作用。     

小陇山油松天然林结构特征

利用固定样地每木定位调查数据和相关分析统计软件,对小陇山林区油松天然林的结构特征进行了分析。结果表明:油松天然林树种组成丰富,群落中共出现18个树种,油松占绝对优势,但样地树种隔离程度较低,属于弱度混交。油松天然林的直径分布为多峰山状曲线,油松种群的直径分布近似于正态分布,可用3参数Weibull分布拟合;树高随胸径的增大而增加,胸径与树高的关系可运用幂函数进行拟合。林分中油松个体的胸径、树高和冠幅的大小分化差异明显,整体上表现为中庸状态;油松天然林林木分布格局为随机分布,油松种群分布格局也为随机分布。     

马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同器官间显著下调表达的时间点存在差异;同时,不同器官pmCaM表达量变化均存在特异的随时间发展的波动特征,其中发现,根茎pmCaM在松材线虫接种45 min时均处于表达量高峰。本研究结果显示pmCaM表达响应了松材线虫侵染,揭示pmCaM可能参与了调控松材线虫-马尾松互作早期的钙信号响应。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

Cloning and analysis of cross-intron genomic gene encoding ACO in Paeonia suffruticosa Andr.

The last step of ethylene biosynthesis in higher plants is to convert 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) to ethylene by ACC oxidase (ACO). In our investigation, a cross-introns genomic DNA gene encoding ACC oxidase, PsgACO, was isolated from Paeonia suffruticosa. It revealed that PsgACO (FJ855434) has 1281 bases, containing four exons and three introns, encoding 312 amino acids. The four exons stretched from 1 to 105, 217 to 434, 592 to 925 and 1000 to 1281 bases. A splicing junction sequence of all the exon-introns conformed to the GT-AG rule in the cross-intron genomic DNA sequence of the ACO gene. PsgACO showed high homology to many characterized ACC oxidases both at the nucleic acid and amino acid levels. As well, twelve amino acid residues were conserved among many ACOs from other species. A phylogenetic tree analysis indicated that the amino acid of ACOs is quite conserved among the different eudicots. The phylogenetic tree showed that both the tree peony and herbaceous peony are quite isolated taxa. Bioinformatic analysis showed that the molecular weight of ACO is 35.29 kD, with a theoretical pI of 5.25. It is a non-secrete, stable hydrophilic protein, located in the cytoplasm.     

植物花色素合成的转录调控研究进展

花色素是由植物类黄酮代谢途径产生的次生代谢产物,决定了花、果实和种子的颜色。随着类黄酮代谢途径的研究不断地深入,多种植物编码合成花色素的结构基因也已得到克隆,并研究证明花色素合成结构基因与转录因子(MYB、 bHLH和WD40)有着极其复杂的相互作用模式。本文主要对花青素合成相关的MYB、bHLH和WD40转录因子及其在调节结构基因表达和花青素合成中的作用进行了综述。     

马尾松谷胱甘肽过氧化物酶PmGPX6基因cDNA克隆及转化拟南芥耐旱性初步研究

[目的]克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因,并对其进行功能研究。[方法]采用RACE技术克隆基因c DNA序列,实时荧光定量PCR检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式,花序浸泡法转化拟南芥,并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行GFP荧光检测。[结果]克隆到1个871 bp的GPX基因全长c DNA序列,命名为Pm GPX6。Pm GPX6包括513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸残基。Pm GPX6蛋白与油松Pt GPX蛋白同源性达95%。Pm GPX6在马尾松根中高表达,茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下,Pm GPX6在根、茎、叶中的表达量均在第15天达到最大,随后出现下降趋势。过表达Pm GPX6与野生型拟南芥植株在正常水分条件下表型与根长差异不大,但在干旱胁迫下,转基因植株根系更长。转基因拟南芥根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光,表明Pm GPX6基因能高效表达。[结论]推测Pm GPX6可能参与马尾松干旱胁迫应答。     

银杏过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达分析

利用RACE技术从银杏中克隆到过氧化氢酶基因(GbCAT1)的cDNA全长。进化树分析结果表明:GbCAT1和其他物种的CAT源自于相同的祖先。Southern杂交显示:GbCAT1属于1个小的多基因家族。实时定量RT-PCR分析表明:GbCAT1在银杏的根、茎、叶和果中都有表达,在叶中的相对表达量最高,其次为果、茎和根。GbCAT1的转录受到ABA、渗透压、紫外、低温和高温胁迫的诱导。水杨酸处理下,GbCAT1相对表达量迅速降低。CAT1基因在逆境条件下的相对表达变化与环境胁迫有关。     

濒危植物大花黄牡丹与生境地群落特征的关系

在濒危植物大花黄牡丹生境地群落学调查的基础上,划分生境地群落类型,分析生境地群落特征,探讨大花黄牡丹与生境地群落特征的相互关系。研究结果表明:TWINSPAN将大花黄牡丹生境地群落划分为乔木群落和灌木群落。乔木群落中大花黄牡丹多度显著低于灌木群落,但大花黄牡丹平均胸径和平均高则与灌木群落无显著差异。群落特征与大花黄牡丹的相关性分析表明:大花黄牡丹多度及平均胸径与群落总多度、灌木多度及乔木物种丰富度存在显著的相关性,而大花黄牡丹多度与乔木多度存在显著负相关,大花黄牡丹平均胸径与群落平均高也存在显著负相关,大花黄牡丹平均胸径及平均高与藤本物种丰富度则存在显著的正相关,具有相关性的变量之间可用不同的回归方程较好的表述。此外,大花黄牡丹冠幅面积、高度、丛数及幼苗数量均与灌丛的冠幅面积存在显著的正相关,但大花黄牡丹幼苗数量在两种群落间无显著性差异。