高效液相色谱-蒸发光检测法测定木薯生氰糖苷的含量

为研究所收集木薯品种叶片中生氰糖苷含量的高低,笔者将所有品种茎杆按木薯正常种植方式扦插于试验地中,在收获季节前采集顶端倒数第2叶,通过HPLC测定各品种叶片中生氰糖苷的含量。结果表明,与国外所用木薯品种‘Mcol22’相比,在笔者所测试的木薯品种中,包括热区大面积推广的‘华南5号’(SC5)和‘华南8号’(SC8)中,大部分生氰糖苷含量都不高,其中‘Q10’生氰糖苷最低,每克鲜重只有11.3μmol,大约是最高含量‘Ecu81’的1/4。研究结果为筛选低生氰糖苷含量的木薯资源提供了一个参考。     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子,发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、Me JA及生长素等激素响应元件,同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理,证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达,其次为嫩叶;在块根发育过程中,MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。     

MeNINVs在不同品种木薯的表达模式及酶活性分析

碱性/中性转化酶(NINV)催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖,是木薯块根的蔗糖分解代谢的关键酶之一。本研究以淀粉含量不同的木薯品种(SC8-高淀粉,SC124-中淀粉,9Ⅰ-低淀粉)为材料,研究木薯块根膨大期,Me NINV基因家族在源库器官的表达模式以及酶活性特点。结果表明,不同品种木薯Me NINVs的表达模式相似,Me NINV1、Me NINV16、Me NINV110及n INV1在叶片中表达量均高于其他成员;同时,Me NINV1和NINV1在块根中的表达量也高于其他成员。不同品种木薯叶片中的Me NINVs表达及酶活性差别不大,但是高淀粉品种SC8块根中的Me NINVs表达量比9Ⅰ低,而NINV酶活性却远高于9Ⅰ,推测木薯NINV酶活性存在转录后调控机制。本研究为进一步研究碱性/中性转化酶在木薯淀粉积累过程中的作用奠定了基础。     

木薯钾离子通道蛋白MeAKT1的基因克隆及转基因拟南芥构建

钾元素参与植物体多种重要的生理功能。AKT1作为钾离子(K+)通道中的重要组分,介导拟南芥根对钾离子的吸收,然而木薯中的AKT1基因尚未被克隆。为探究木薯AKT1基因的功能,本研究通过qRT-PCR检测低钾处理后木薯中AKT1基因的表达量,发现木薯中AKT1基因的表达量在低钾处理后升高,可知木薯AKT1基因在木薯响应低钾胁迫中发挥作用。通过PCR扩增获得木薯AKT1基因的目的片段,将该片段连接到过表达载体pEGAD中,转化到拟南芥,获得转基因植株,并对木薯AKT1基因的启动子区域进行分析。这将为进一步研究木薯中AKT1基因的生理功能及其在木薯抗低钾胁迫中的作用机制提供帮助。     

低氮条件下黄瓜寡肽转运蛋白（OPT）基因的克隆及表达分析

根据黄瓜基因组数据库中Csa020719基因编码区全序列设计引物,通过RT-PCR扩增的方法从黄瓜品种津研四号的叶片中克隆得到寡肽转运蛋白基因(oligopeptide transporter gene, OPT)。基因编码区全长为2013 bp。该基因编码的蛋白由20种氨基酸组成,含有670个氨基酸残基,分子量和理论等电点分别为73 kD和8.65。预测由该基因转录的寡肽转运蛋白为疏水蛋白,有14个连续的疏水片断。预测该蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白,存在OPT家族保守结构域,亚细胞定位在细胞膜上,主要功能为参与转运和底物结合。同源性和进化树的预测分析显示,OPT蛋白与毛果杨和蓖麻寡肽转运蛋白同源性分别达到了81%和79%,所转运的底物除有寡肽外,还包含有金属离子-烟草胺的螯合物等。 qRT-PCR分析同一氮浓度处理OPT基因在不同部位表达结果显示,在无氮及低氮条件下,OPT基因在茎中表达量最高,其次为叶和茎尖。在高氮条件下,OPT主要在茎尖和叶中表达量较高,其次为茎,说明OPT基因在氮胁迫下存在于植物各个部位,并主要集中在生长旺盛的部位,为黄瓜的生长提供所需的能量。不同氮浓度下OPT在茎中表达分析结果显示,OPT基因在无氮及低氮下表达量增加,明显高于正常水平,并且随着氮浓度的降低,OPT的表达量增加,说明黄瓜OPT基因参与低氮胁迫应答反应,增强黄瓜耐低氮能力。     

低氮条件下木薯谷氨酰胺合成酶(GS)酶活及GS家族基因表达分析

谷氨酰胺合成酶(GS)是植物氮代谢中的关键酶,在氨同化和谷氨酰胺生物合成中起着重要的作用。木薯中谷氨酰胺合成酶基因家族有四个基因,分别是细胞质型cassava4.1_008086m(Me GS1.1),cassava4.1_010581m(Me GS1.2),cassava4.1_010597m(Me GS1.3)和叶绿体型cassava4.1_008019m(Me GS2)。实验采用q RT-PCR技术分析铵盐和硝酸盐两种不同的氮源低氮胁迫下耐低氮品种(双高CH16)和低氮敏感型品种(双低G16)GS基因的表达差异。结果表明,在低铵盐氮源处理下木薯两类品种的GS酶活在叶中要高于正常氮源处理,根中低于正常氮源处理,而低硝酸盐氮源处理下木薯两类品种的GS酶活在叶和根中要低于正常氮源。在不同低氮源处理下,两类材料叶绿体型GS表达量在叶中始终与GS酶活存在相反现象。因此,推测木薯叶片中叶绿体型GS表达量可能与GS酶活呈负相关关系。而细胞质型GS表达量差异较大,与叶绿体型GS共同影响GS酶活,影响着木薯的氮利用效率。     

海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因Gbar_A11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (Days post anthesis),该基因在高FS (Fiber strength)材料中的表达量显著高于低FS材料,且在高FS材料中明显上调表达;氨基酸序列分析表明,GbMYB5基因的编码区长747 bp,编码248个氨基酸残基,氨基酸序列包含1个高度保守的HTH-myb DNA-binding domain;序列同源比较及系统发育进化表明,该基因与不同物种的MYB5相关蛋白氨基酸序列都存在1个高度保守的HTH结构域;GbMYB5和雷蒙德氏棉的MYB5聚集在同一分支上,该基因与雷蒙德氏棉的同类基因亲缘关系较近。利用qRT-PCR分析不同组织表达情况,发现GbMYB5基因在花瓣和花萼中极显著表达量,雌蕊和雄蕊中显著表达一般,茎组织中表达不显著。研究初步分析了该基因的氨基酸序列及表达模式,为今后棉花MYB转录因子在纤维发育阶段的功能及分子机制的研究提供依据。     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。     

梨茎尖中PpKO基因表达量的实时荧光定量PCR分析

以黄金梨不同发育时间的新梢茎尖为试材,应用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA、Actin、GAPDH和S19这4个常用内参基因在梨茎尖组织中的表达稳定性进行了评估。GeNorm软件分析显示,它们表达稳定度的平均值(M)依次是0.365,0.392,0.457和0.517,即表达稳定性从高到低的排序是:Actin18S rRNAGADPHS19。选择Actin作为校正内参基因,对处于不同发育时期的新梢茎尖组织中贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的表达量进行研究,发现该基因在新梢生长过程中出现2次表达高峰,基本与春梢、秋梢的快速生长期吻合,且秋梢中的表达量远高于春梢。     

Association and Path Coefficients Analysis of Fresh Root Yield of High and Low Cyanide Cassava (Manihot esculenta Crantz) Genotypes in the Humid Tropics

Thirty-eight high- and low-cyanide cassava genotypes were examined in the 2004 and 2005 cropping seasons at Umudike, southeastern Nigeria using RCBD with three replications. Simple correlation associations and path coefficients analyses were computed among agronomic characters with the aim of understanding the interrelationships of these characters and the extent of their contribution to the root yield of cassava. There was a significant (P 2 0.05) positive correlation between root yield and number of roots plant-1 with correlation coefficients (r) of 0.57, average weight of root (r = 0.58) in high-cyanide cassava genotypes, while in low cyanide cassava genotypes, fresh root yield was highly significantly (P 2 0.01) correlated with average weight of root (r = 0.74). Path analysis showed that average weight of root had the highest direct effect in high (0.66) and in low cyanide (0.67) cassava genotypes. Also, the number of roots plant-1 in both types of cassava exerted a positive direct effect on fresh root yield, however, a minimum effect was obtained by number of leaves plant-1 (0.22) in high-cyanide cassava and number of stems plant-1 (-0.13) in lowcyanide cassava genotypes. Average weight of roots in high- and low-cyanide cassava genotypes had 98 and 89% direct effects, respectively, on yield of cassava. The results indicated the importance of average weight of roots and other characters such as number of roots plant-1, plant height, and number of leaves plant-1 in determining increased yield hence priority must be accorded it during selection aimed at increasing cassava root yield.     

七个木薯品种的氢氰酸含量研究

为了研究木薯不同品种的氢氰酸含量差异,本研究选用硝酸银滴定法,对七个不同品种木薯（‘华南5号’、‘华南7号’、‘华南9号’、‘华南124’、‘华南205’、‘华南8013’、‘ZM8625’）不同部位（叶片、茎秆、去周皮块根和带周皮块根）的氢氰酸的含量进行测定。结果表明,七个品种木薯叶片中氢氰酸含量最高的是‘华南9号’,最低的是‘华南8013’;茎秆中氢氰酸含量最高的是‘ZM8625’,最低的是‘华南9号’;去周皮块根和带周皮块根中氢氰酸含量最高的均是‘华南205’,带周皮块根中最低的是华南7号’,去周皮块根中最低的是‘华南9号’;‘华南205’各部位的氢氰酸含量均较高。七个品种木薯叶片和茎秆氢氰酸含量均大于块根中氢氰酸含量,带周皮块根氢氰酸含量均约为去周皮块根氢氰酸含量的2倍,去周皮块根氢氰酸含量均极显著低于其他部位。结果说明,木薯氢氰酸含量主要大量集中在叶片、茎杆和周皮中;华南8013叶片可开发为优质菜用或饲料资源,华南9号块根可开发为优质食用或饲用资源。     

烘干脱毒对木薯叶中氰化物和总黄酮含量的影响

木薯叶中总黄酮含量比较丰富,同时也含有有毒物质——氰化物,严重制约木薯叶的综合利用。为了脱去木薯叶中的氰化物,并且使总黄酮含量尽量保留,本实验采用烘干的方法脱去氰化物。在本研究中温度设65℃、75℃、85℃三个梯度,时间设6、7、8 h三个梯度,分为9组,并同时测定各组中总黄酮的含量。实验结果表明较优的脱毒条件为75℃,6 h,在此脱毒条件下,氰化物含量符合国家标准,并且总黄酮损失相对较少。本实验结果可为木薯叶的综合利用提供参考。     

不同生长期木薯叶片的品质比较分析

为提高木薯副产物综合利用率，以‘SC9’、‘SC12’、‘SC6068’、‘热引1 号’4 个食用木薯品种的叶片为研究对象，比较分析幼叶、嫩叶、老叶3 个生长期，不同脱氰处理对其氢氰酸、总黄酮、蛋白质等品质指标的影响，并利用SAS系统进行主成分综合评价。结果表明，烘干处理后叶片的营养损失较少，但氰化物含量极显著高于食品安全标准；70℃水浴处理后氰化物含量在食品安全范围内，但总黄酮含量急剧降低。从品种和叶片生长期各指标看，品种间和不同生长期间均存在显著差异，其中‘SC6068’叶片总黄酮最高，达31.663 mg/g。经主成分综合评价发现，从生育期看，4个品种嫩叶烘干处理优于70℃水浴处理，但氰化物含量偏高；从品种看，‘SC12’和‘SC6068’2 个品种烘干处理优于70℃水浴处理，其综合评价值F1分别是2.5892、2.5272，可考虑将其作为食品和抗氧化活性物质资源化开发利用。总之，本研究表明不同木薯品种叶片加工利用方式与叶片黄酮含量和氰化物含量密切相关，直接干燥对黄酮类物质的影响较小，适用于发酵型饲料加工利用；而70℃水浴处理叶片氰化物含量较低，适用于食品原料加工。     

Linamarin content and genetic stability of cassava plants derived by somatic embryogenesis

A protocol was established for high frequency cyclic somatic embryogenesis for different varieties of cassava. An efficient plant regeneration system was developed for the high cyanogenic variety PRC60a. Linamarin content and linamarase activity were determined in various tissues of secondary somatic embryos and regenerated plants of PRC 60a. Both linamarin and linamarase activity were not detected in embryogenic callus, roots induced from callus and somatic embryo tissues. The stems and leaves of regenerated plants (in vitro) and storage roots and leaves of mature plants (in vivo), however, contained variable amounts of linamarin and linamarase activity whereas in the non storage root tissues (in vitro) only linamarin was detected. The present study suggested that the linamarin biosynthetic pathway may be absent or not switched on in the embryogenic callus and somatic embryos. The ploidy level and somatic chromosome number of the regenerated plants were found to be same as the source plants. The availability of this regeneration system would be useful not only for investigating cyanogenesis but also for genetic manipulation in cassava. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

异黄酮含量与大豆对大豆蚜虫抗性之间的关系

利用高效液相色谱分析方法测定了10个抗感大豆品种蚜虫取食处理叶片和茎的异黄酮含量。结果表明,蚜虫取食诱导抗虫品种叶片大豆苷、染料木苷和异黄酮总含量增加,而感蚜品种异黄酮含量无明显变化。相关分析表明,大豆品种受害程度与叶片大豆苷、染料木苷和异黄酮总含量呈负相关。但茎的异黄酮含量与大豆品种的抗蚜性无明显相关。     

色素万寿菊中叶黄素合成相关基因的表达分析

本项研究以生产中用于杂交制种的8个色素万寿菊品种资源的花蕾期(Ⅰ)、鲜花半开期(Ⅱ)、鲜花盛开期(Ⅲ)的花瓣以及盛开期时的叶子(Ⅳ)为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测了叶黄素合成过程中3个相关基因lcyb(lycopene b-cyclase)、lcye(lycopene e-cyclase)和zds(ζ-carotene desaturase)在8个供试品种的不同发育时期的相对表达量。结果表明:3个基因的表达量在叶片中依次为lcyb>zds>lcye,花瓣中依次为lcye>zds>lcyb。lcye在花瓣中的表达量随花瓣的开放程度呈现先升高后降低的趋势,并在Ⅱ期达到最大值,且均高于叶片中lcye的表达量。Zds的表达趋势为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ。Lcyb在叶中的表达高于花瓣中的任何时期。父本花瓣Ⅲ期的lcye表达量高于其他品种,且它的叶片中的lcyb的表达也高于其它品种。本项研究结果将有助于进一步阐明lcyb、lcye和zds基因与色素万寿菊叶黄素合成积累之间的关系,为进行色素万寿菊的基因工程育种奠定基础。     

MS培养基不同成分对马铃薯脱毒试管苗生长的影响

为了探索马铃薯脱毒苗高效低成本快繁培养基,以‘陇薯7号’和‘陇薯20号’试管苗为试材,测定不同培养基上试管苗的株高、茎粗、叶片数、茎叶鲜干重和叶绿素含量。以除去有机的MS培养基为对照,在仅缺钙的培养基上,两品种都能正常生长,但‘陇薯20号’的株高显著低于对照;仅缺乏微量元素或同时缺乏钙盐和微量元素时,‘陇薯7号’与对照无显著差异,但‘陇薯20号’的株高显著低于对照;缺铁使‘陇薯7号’新芽失绿,生长受阻,但对‘陇薯20号’没有产生不利影响,且铁和钙盐同时缺乏有利于‘陇薯20号’的生长;在只含MS大量元素的培养基培养时,两品种前期均出现茎叶微黄的现象,但随培养时间的延长,黄色逐渐消失,且‘陇薯7号’的各指标显著高于对照。由此可见,不同品种对营养元素的需求差异较大,‘陇薯7号’和‘陇薯20号’分别可以在只含大量元素和大量元素+微量元素的MS培养基上高效快繁。     

Isozyme electrophoregrams of sixteen enzymes in five tissues of cassava (Manihot esculenta Crantz) varieties

Summary Methodology, based on starch and polyacrylamide gel electrophoresis, was developed for determining isozyme electrophoregrams (patterns) of 16 enzymes of cassava (Manihot esculenta Grantz) varieties as potential genotype markers. Extracts of five different tissues (root, stem, leaf, petiole and bud) were examined. In general, the nodal portions of the shoots gave isozyme patterns with the largest number of bands. Petiole extracts gave similar results but bud extracts gave poor patterns. The limited number of varieties that were examined could be distinguished by sequential classification on the basis of the isozyme patterns of acid phosphatase, esterase, glutamate oxaloacetase transaminase and phosphoglucoisomerase.Joint publication of the Centro Internacional de Agricultura Tropical and the Department of Plant Science (No. 716), University of Manitoba. Presented in part at the 2nd International Symposium on Biochemical Approaches to Identification of Cultivars and Evaluation of Their Properties, 5–9 May, 1985, Braunschweig, West Germany.