家蚕法尼酸甲基转移酶(FAMeT)基因的鉴定及表达模式分析

保幼激素(JH)是昆虫生长、发育、变态和生殖等一系列生理生化过程中必不可少的一类激素。法尼酸甲基转移酶(farnesoic acid O-methyltransferase,FAMeT)被认为是昆虫及其它节肢动物催化合成保幼激素前体甲基法尼酸(methyl farne-soate,MF)的关键酶。通过生物信息学分析,从家蚕全基因组数据中共鉴定了7个编码家蚕FAMeT的基因(BmFAMeT1～BmFAMeT7)。系统进化分析暗示BmFAMeT2可能是家蚕FAMeT家族成员的最原始拷贝。对其中位于6号染色体上的BmFAMeT5、BmFAMeT6和BmFAMeT7的时空表达谱分析显示,3个基因从家蚕胚胎发育后期至成虫期持续性表达;在5龄第3天幼虫中肠组织特异性高水平表达。利用RACE技术克隆获得了这3个基因的全长cDNA序列,并发现BmFAMeT5及BmFAMeT6分别存在2种不同的选择性拼接形式。上述结果为进一步研究家蚕FAMeT的生物学功能提供了线索。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕A型咽侧体抑制激素对白僵菌感染的抑制作用

家蚕是鳞翅目昆虫的代表,具有重要的经济价值和昆虫免疫机制研究价值。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为致病力最强、危害最严重的病原真菌之一,其感染引起的家蚕真菌病常给养蚕业带来严重损失。如何有效防治该病的发生一直是重要的研究课题。我们前期研究中发现在球孢白僵菌感染的家蚕中A型咽侧体抑制激素(A type Allatostatin, AST-A)基因的表达水平明显上调,推测其可能参与家蚕对球孢白僵菌感染的免疫反应。为探究AST-A在家蚕抵御球孢白僵菌感染过程中的作用,从家蚕克隆了AST-A基因的cDNA,采用原核表达系统表达获得了重组家蚕A型咽侧体抑制激素(BmAST-A)蛋白,经镍柱层析纯化后,进行了BmAST-A蛋白的体内试验以及BmAST-A基因的RNA干涉试验,检测其对球孢白僵菌感染的抑制作用。结果显示,对球孢白僵菌感染的家蚕5龄幼虫体腔注射纯化的重组BmAST-A蛋白,幼虫半数致死时间比对照组延迟了32.9 h,而采用RNAi沉默BmAST-A基因的表达,幼虫的半数致死时间比对照组提早了16.8 h。上述结果表明,BmAST-A在家蚕抵御球孢白僵菌感染的过程中发挥了重要作用。     

BmLSP基因启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析

家蚕幼虫血清蛋白(BmLSP)是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。基于家蚕基因组数据,克隆了BmLSP基因5'端侧翼区～1.6 kb的调控序列,构建成以红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因的pig-gyBac表达载体并进行转基因注射,在个体水平上验证该启动子的特性。结果表明:BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组;DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。     

家蚕保幼激素信号途径中转录因子BmKr-h1的基因克隆与表达分析

Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现大部分昆虫物种的Kr-h1都含有8个锌指结构,暗示该蛋白质的功能具有一定的保守性。通过生物信息学方法预测Bm Kr-h1不含信号肽和糖基化位点,但含有19个可能的磷酸化位点,暗示其活性可能受到磷酸化和去磷酸化修饰的影响。利用原核表达系统表达获得了可溶的Bm Kr-h1蛋白并制备了抗体。Western blot和半定量RT-PCR检测的结果显示,不论在mRNA水平还是蛋白质水平,Bm Kr-h1在家蚕幼虫5龄初期和吐丝期的翅原基都有较高水平表达,而在蛹期的表达量较低。用保幼激素(JH)类似物Methoprene和蜕皮激素(20E)分别注射家蚕5龄第3天幼虫,发现2种激素均能诱导蚕体内Bm Kr-h1的表达上调。免疫组织化学结果显示,Bm Kr-h1在5龄第3天幼虫各组织中的表达量很低,而在吐丝期的中肠、脂肪体和表皮中都有一定水平的表达,暗示其可能参与家蚕蜕皮变态的过程。上述结果表明Bm Kr-h1可以响应JH和20E的诱导,提示其在家蚕的变态发育中发挥作用。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。     

家蚕胚胎发育相关基因的分析(英文)

在家蚕基因组中检索分析了与果蝇86个胚胎发育相关基因同源的基因。分析结果表明,在果蝇的这86个基因中,有62(72%)个基因在家蚕基因组中存在直向同源关系,其中58(67%)个基因并且在家蚕、果蝇、冈比亚按蚊3种昆虫的基因组间呈现1∶1∶1直向同源关系。通过比较分析发现,体节极性决定基因在3种昆虫基因组间最为保守。同果蝇和冈比亚按蚊相比,家蚕中决定背-腹部形成的基因分化最大。进一步利用芯片数据对其中的12个母性基因在家蚕5龄第3天幼虫生殖腺中的表达情况进行分析:有2个基因(orb和nanos)在卵巢中特异表达;4个基因(spire、Ras85D、gd和arrest)在精巢中特异表达;另外的6个基因(exuperantia、vasa、pumilio、mago nashi、nudel和dorsal)在精巢和卵巢中均有表达,但是其中的2个基因(pumilio和nudel)在雌、雄间的表达量存在显著差异。研究结果为家蚕发育调控机制的进一步研究提供了重要线索和数据信息。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

氟化物对不同抗性家蚕品种的GST和AChE酶活性影响及雌雄个体间的酶活性差异

为了探明家蚕的耐氟性机制以及耐氟性在不同性别蚕体间的差异,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,自5龄起蚕开始分雌雄喂食清水和200 mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,检测幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。添食氟化物后耐氟和敏感家蚕品种5龄幼虫中肠的GST活力随添氟时间的变化趋势与对照组比较一致,且与对照组相比酶活性均呈增高趋势;敏感品种734添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.486倍,耐氟品种T6添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.529倍。敏感品种734对照组5龄幼虫在试验第3天头部的AChE酶活性显著升高,但添氟组雄蚕在试验第2天AChE酶活性即显著升高,而雌蚕的AChE酶活性在整个5龄试验期均呈平缓下降趋势;耐氟品种T6添氟组5龄雌、雄幼虫的AChE活力与对照组差异不大,酶活力随添氟时间的变化趋势也与对照组较为一致,均在第3天出现最低值;2个品种添氟组AChE酶活性的性别差异与GST相反,即雄蚕的AChE平均活力大于雌蚕。推测氟化物处理后耐氟家蚕品种仍然能够保持AChE酶活性水平,从而呈现对氟化物的耐受性;2种类型解毒酶活力在雌雄家蚕间的差异可能暗示同一品种雄蚕的耐氟能力较多涉及靶标抗性,而雌蚕的耐氟能力较多依赖于代谢抗性。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。     

家蚕谷胱甘肽硫-转移酶的组织分布及发育期变化规律

为明确家蚕谷胱甘肽硫-转移酶(GSTs)的生物学信息,对家蚕不同发育阶段GSTs的变化规律、5龄幼虫主要组织及不同品种间的GSTs活性差异进行了研究。家蚕GSTs在中肠、脂肪体、血淋巴、表皮、头部等组织中都有分布,脂肪体中GSTs活性最高,其次是中肠,头部最低。各发育阶段中,在由一种虫态变为另一种虫态的初始期GSTs活性较高,以后逐渐降低。在幼虫主要组织中GSTs活性5龄第3天最高,以后逐渐下降,至吐丝前达到较低的水平。抗性较强的夏秋蚕品种的GSTs活性高于春用蚕品种,杂交种的GSTs活性高于原种。研究结果提示家蚕GSTs活性与其组织器官的生理功能、品种抵抗性等相关联。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。     

细胞周期素家族基因在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中的转录特征

细胞周期蛋白(cyclin)是真核生物细胞有丝分裂的重要调节蛋白,家蚕具有5种类型细胞周期蛋白基因。以4龄将眠蚕、4龄眠蚕和5龄起蚕为材料,采用定量PCR方法分析5种细胞周期蛋白基因在4龄幼虫蜕皮过程的组织表达特征为:5种类型cyclin基因在生殖腺中都高表达,其中cyclinE在眠中表达量最高,其它4种类型cyclin基因在将眠时表达量最高,证实4龄眠期是家蚕生殖腺细胞发生有丝分裂的重要时期;5种类型cyclin基因在马氏管中都有表达,其中cyclinA和cyclinB3在4龄将眠蚕的马氏管中存在表达高峰,推测和马氏管内表皮更新相关;除cyclinL1在眠蚕丝腺的表达量很低外,cyclinA、cyclinB、cyclinB3和cyclinE在眠蚕丝腺中都存在表达高峰,可能和丝腺的内表皮更新相关;cyclinA、cyclinB、cyclinB3在脂肪体中的表达量较高,且在将眠时或眠中存在表达高峰,推测和脂肪体中能量物质的积累相关;5种类型cyclin基因在脑、血液和中肠的表达量都很低,且蜕皮前后的变化规律不明显。研究结果提示:在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中,cyclin基因的转录特征不仅和来源于外胚层组织的表皮更新相关,还和生殖腺的发育及脂肪体中能量物质的积累存在相关性。     

昆虫外源激素对家蚕生长发育的影响及其相互关系的研究

用昆虫保幼激素(JH),蜕皮激素(MH)和抗保幼激素(AJH)给家蚕添食、体涂或注射,进行调控其生长发育的试验。结果表明:(1)2龄、3龄和4龄蚕应用外源激素处理,AJH与MH之间存在明显的拮抗关系;而AJH与JH间未表现出拮抗关系。(2)第5龄蚕应用外源激素处理,JH与MH间的拮抗关系明显。(3)AJH(YA_(20))对家蚕生长发育的影响,主要表现为抗蜕皮激素和类似保幼激素的生理效应。在第4龄添食AJH诱导3眠蚕的情况下,利用JH延长3眠蚕的龄期经过,是提高3眠蚕茧丝产量的技术途径之一。     

氟中毒对桑蚕碱性磷酸酶活性及蚕体重的影响

本文通过添食NaF的方法，探讨了氟中毒对天体重及中肠组织ALKP酶活性的影响，蚕品种之间的耐氟性存在显著差异，氟中毒后蚕体重显著降低，NaF对中肠组织ALKP酶有明显的抑制作用，氟中毒后蚕体重变化与中肠组织ALKP酶活性的变化相关性密切，具有同步性，1％Ca^2 对氟化物抑制作用有一定的缓解作用。     

栗蚕幼虫酯酶同工酶酶谱多态性及应用于品种间亲缘关系的分析

栗蚕是珍稀的野蚕资源。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,测定栗蚕幼虫不同发育时期、不同组织器官的酯酶同工酶酶谱,并依据酯酶同工酶酶谱的多态性分析纯黑、纯绿2个品种的亲缘关系。检测结果表明:栗蚕幼虫中肠的酯酶同工酶活性和酶带数随龄期而增加,且同一龄期以盛食期的酶表达量最高;幼虫中肠及脂肪体中的酯酶同工酶活性较强,并且酶带数较多;2个供试品种间的酯酶同工酶酶谱明显不同。根据酶谱差异分析2个品种的遗传相似系数为0.86,表现出较近的亲缘关系。研究结果提示:栗蚕幼虫酯酶同工酶的酶活性和酶带数与生长发育和组织功能有关,幼虫酯酶同工酶酶谱可以作为分析品种间亲缘关系的依据之一。