PrP106-126对星形胶质细胞层黏连蛋白和纤黏连蛋白表达的影响

星形胶质细胞增生是朊病毒病早期的主要病理学特征.PrP106-126 (prion protein peptide 106-126)具神经毒性,导致星形胶质细胞增生.层黏连蛋白(laminin,LN)和纤黏连蛋白(fibronectin,FN)是星形胶质细胞胞外基质的主要成分.利用PrP106-126和PrP106-126制备的小胶质条件培养基(condi-tioned medium from microglia,MiCM)分别作用于体外培养的星形胶质细胞,应用RT-PCR和Westernblot技术探讨PrP106-126对星形胶质细胞的增殖及其胞内LN、FN表达的影响.试验分为5个处理(空白对照、Scr对照、PrP106-126、MiCM、MiCMPrP106-126).结果表明,PrP106-126可促进星形胶质细胞增殖、LN和FN的表达,但促增殖和FN表达作用有赖于活化小胶质细胞细胞因子的共同参与.     

BAT3过表达缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的神经元凋亡

拟检测BAT3蛋白过表达对由PrP106-126毒性多肽引起的神经元凋亡现象的影响。首先通过免疫荧光、CCK8细胞活性检测试剂盒和免疫印迹检测带FITC标签的PrP106-126-FITC毒性多肽的生物学毒性。分别用PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽处理原代神经元和Neuro2a细胞,通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受刺激后的原代神经元和Neuro2a细胞中BAT3表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pcDNA-3.1-HA-BAT3质粒转染进入原代神经元,用CCK8检测细胞活性;以同样方式将质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系Neuro2a,用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平;Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后,胞质内细胞色素C和Bcl-2的变化,进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥作用的机制。结果显示,PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽具有相似的神经毒性。受到多肽刺激之后,无论在原代神经元还是传代细胞系Neuro2a中,BAT3都发生核输出现象,BAT3从细胞核转移进入细胞质。BAT3的过表达使受到PrP106-126毒性多肽刺激的神经元的细胞活性有所提高,Neuro2a的细胞凋亡现象减轻,同时抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的细胞色素C的过度释放并且维持细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的稳定。BAT3蛋白的表达缓解PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡现象,为进一步阐释该蛋白质对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了依据。     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元死亡

为检测神经元限制性沉默因子(REST)蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元死亡的影响,首先通过脂质体转染法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激构建好的REST过表达或干扰的原代神经元,利用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞活性;利用TUNEL和Hoechest试剂盒,在激光共聚焦显微镜下直接观察细胞凋亡情况;在透射电镜下观察原代神经元亚细胞结构的变化和损伤情况;使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位的改变,同时检测凋亡相关蛋白FOXO1、细胞色素C以及Caspase-3的变化情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST的过表达可减轻由毒性多肽引起的神经元死亡、神经元空泡化、细胞器损伤,抑制线粒体膜电位的改变,维持促存活蛋白FOXO1的表达,阻止线粒体向胞浆中释放细胞色素C以及Caspase-3的激活。相应地,干扰REST后,可加剧毒性多肽对神经元的损伤并抑制FOXO1的表达。这表明REST蛋白的过表达可缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经元死亡,对神经元起保护作用,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供依据。     

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

PrP106-126对大脑皮质神经元和星形胶质细胞朊蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR的方法,对PrP106-126处理的大脑皮质神经元和星形胶质细胞模型进行了朊蛋白基因表达相对定量的研究。大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达量明显下降。PrP106-126处理的星形胶质细胞与对照组和SCR处理组相比,朊蛋白基因的表达量显著升高。该试验结果为深入了解TSEs的分子致病机制和正常朊蛋白的功能提供了基础数据。     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元突触和神经纤维的损伤

为了检测REST蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元纤维的影响,本试验通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受PrP106-126刺激后的原代神经元中REST表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染进入原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激转染了REST过表达或干扰质粒的原代神经元,利用免疫印迹检测突触后蛋白PSD-95的变化情况;利用免疫荧光观察突触后蛋白和神经纤维的损伤情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST从神经元的胞浆向胞核转移的同时表达量也逐渐增加,24h时达到顶峰,之后缓慢减少。生理情况下,过表达REST促进突触后蛋白PSD-95的表达;病理情况下,REST的过表达减轻由毒性多肽引起的突触损伤、神经纤维断裂。相应地,干扰REST后,加剧毒性多肽对神经纤维的损伤。结果表明,REST蛋白的过表达缓解PrP106-126毒性多肽对原代神经细胞造成的病理性损伤,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供了理论依据。     

多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响

试验旨在研究多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响。本研究利用多肽PrP106-126作用于小脑颗粒神经细胞,对该多肽影响小脑颗粒神经细胞凋亡基因的表达进行了检测。结果表明:bax、caspase-3和myc基因在PrP106-126多肽作用后表达显著增加,而bcl-2基因表达明显下降,进一步验证了bax、caspase-3和myc基因具有诱导凋亡作用,而bcl-2基因则具有抑制凋亡作用。     

PrP106—126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106—126具神经毒性,是研究异常腕蛋白（PrPSc）的理想工具。为探讨PrP106—126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106—126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力（reactiveoxygenspecies,ROs）进行检测,并通过荧光定量RT—PCR对与R0s相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrPl06—126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT—PCR显示,PrP106—126显著降低细胞S0D-1（P〈0．01）表达水平、提高胞内Cat（P〈0．01）的表达水平;对Grx、Trx-1、和Trx-2mRNA的表达水平有升高的趋势,但未达到显著水平（P〉0．05）,对SOd-2、GPx、GR无显著性影响（P〉0．05）。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。     

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。     

Fe~(3+)与PrP106-126共同诱导下N2a细胞的氧化应激状态

利用PrP106-126多肽的神经毒性,结合Fe3+对细胞氧化应激可能的诱导作用,建立N2a细胞的氧化应激模型,以研究氧化应激在Prion疾病过程中的作用,及其诱导神经细胞退行性损伤的机制。试验表明,通过毒性多肽PrP106-126与Fe3+共同作用,模拟神经细胞的氧化应激状态是可行的。效果较佳的攻毒浓度和攻毒时间分别是不高于50μmol/L的毒性PrP106-126多肽,不高于500μmol/L的Fe3+,最佳攻毒时间为12h。     

褪黑素对LPS致大鼠海马炎性损伤的保护作用

本研究旨在探究褪黑素(MT)对脂多糖(LPS)致大鼠海马炎性损伤的保护作用。选取40只4周龄健康雄性SD大鼠,随机分为4组:空白组(CON组)、模型组(LPS组)、褪黑素干预组(LPS+MT组)及褪黑素组(MT组)。通过腹腔注射的方式给予大鼠10 mg·kg~(-1)MT和/或10 mg·kg~(-1)LPS,4 h后,采用旷场试验对各组大鼠进行行为学测试;试验结束称大鼠体重,解剖取海马称重并计算海马体系数;苏木精-伊红(HE)染色观察脑切片中海马区域病理变化;RT-PCR技术检测海马中小胶质细胞激活标记物Iba-1和CD11b mRNA表达;Western blot法检测海马中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β蛋白表达。结果表明,与CON组相比,LPS组大鼠自主探索行为减少、运动能力下降,海马组织神经细胞排列松散、细胞间隙增大、胞质固缩深染、胶质细胞浸润,小胶质细胞激活标志物Iba-1和CD11b mRNA表达极显著升高(P0.01),促炎因子IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表达极显著升高(P0.01),抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表达极显著降低(P0.01)。而与LPS组相比,LPS+MT组大鼠自主探索行为增加、运动能力增强,海马组织神经细胞排列紧密,未见明显病变,小胶质细胞激活标记物Iba-1和CD11b mRNA表达极显著降低(P0.01),促炎因子IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表达极显著降低(P0.01),抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表达极显著增加(P0.01)。此外,MT组与CON组相比,所有指标差异均不显著(P0.05)。结果提示,MT可抑制小胶质细胞激活,减轻海马炎症反应,从而改善LPS造成的大鼠海马炎性损伤。     

褪黑素对LPS致大鼠海马炎性损伤的保护作用

本研究旨在探究褪黑素（MT）对脂多糖（LPS）致大鼠海马炎性损伤的保护作用。选取40只4周龄健康雄性SD大鼠,随机分为4组：空白组（CON组）、模型组（LPS组）、褪黑素干预组（LPS+MT组）及褪黑素组（MT组）。通过腹腔注射的方式给予大鼠10 mg·kg^-1MT和/或10 mg·kg^-1LPS,4 h后,采用旷场试验对各组大鼠进行行为学测试;试验结束称大鼠体重,解剖取海马称重并计算海马体系数;苏木精-伊红（HE）染色观察脑切片中海马区域病理变化;RT-PCR技术检测海马中小胶质细胞激活标记物Iba-1和CD11b mRNA表达;Western blot法检测海马中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β蛋白表达。结果表明,与CON组相比,LPS组大鼠自主探索行为减少、运动能力下降,海马组织神经细胞排列松散、细胞间隙增大、胞质固缩深染、胶质细胞浸润,小胶质细胞激活标志物Iba-1和CD11b mRNA表达极显著升高（P<0.01）,促炎因子IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表达极显著升高（P<0.01）,抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表达极显著降低（P<0.01）。而与LPS组相比,LPS+MT组大鼠自主探索行为增加、运动能力增强,海马组织神经细胞排列紧密,未见明显病变,小胶质细胞激活标记物Iba-1和CD11b mRNA表达极显著降低（P<0.01）,促炎因子IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表达极显著降低（P<0.01）,抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表达极显著增加（P<0.01）。此外,MT组与CON组相比,所有指标差异均不显著（P>0.05）。结果提示,MT可抑制小胶质细胞激活,减轻海马炎症反应,从而改善LPS造成的大鼠海马炎性损伤。     

N-乙酰-半胱氨酸对炎症反应中BV-2细胞的保护作用

为了明确N-乙酰-半胱氨酸(NAC)在LPS诱导的BV-2细胞炎症反应中的保护作用,本研究利用流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)、超氧阴离子自由基(O_2~(·-))和线粒体超氧化物(MitoSOX)水平;ELISA和实时荧光定量PCR法检测IL-1β、IL-6和TNF-α表达;脂质氧化产物丙二醛(MDA)试剂盒检测细胞MDA含量;流式细胞术检测细胞凋亡水平。通过对细胞氧化应激、促炎因子表达、脂质损伤和细胞凋亡的检测,探讨NAC对BV-2细胞炎症反应的保护作用。结果显示,LPS可以使BV-2细胞总ROS、O_2~(·-)和MitoSOX的表达显著上升,加入NAC后ROS、O_2~(·-)和MitoSOX的水平又显著下降。LPS可使BV-2细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著升高,加入NAC后IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著下降(P0.05)。LPS处理4 h后细胞MDA含量显著增加(P0.05),细胞凋亡水平升高,而加入NAC后MDA含量及细胞凋亡水平显著下降。结果表明,NAC可以抑制LPS引起的BV-2细胞氧化应激,使促炎因子表达减少,同时使BV-2细胞脂质损伤减弱和细胞凋亡水平下降,NAC可对细胞炎症反应中BV-2细胞起到很好的保护作用。     

蒲公英提取物对LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子分泌的影响

采用MTT法检测蒲公英提取物对LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞的毒性作用,并应用ELISA法测定蒲公英提取物对脂多糖LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-β的含量.结果表明,蒲公英提取物在≤1 mg/mL剂量范围内对巨噬细胞无细胞毒作用,对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-6和IL-1β分泌具有明...     

増液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构、血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响

为了探讨增液承气汤对热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构及血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响,给热结肠道型气分证模型大鼠预防性或治疗性灌服增液承气汤,测定大鼠体温、体重、肠道黏膜组织结构变化和血清相关炎性细胞因子含量。结果表明:热结肠道型气分证大鼠肠道屏障功能受损,肠道黏膜脱落,部分绒毛断裂,炎性细胞浸润,上皮内淋巴细胞(IEL)数量增多,杯状细胞(GC)数量减少,且血清中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α均会出现显著升高(P0.05)。预防性给予增液承气汤后,可有效减轻肠道黏膜脱落,绒毛断裂和炎性细胞浸润等损伤,并能有效降低大鼠血清中IL-6和TNF-α含量(P0.05);治疗性给予增液承气汤能有效地降低大鼠体温,使大鼠肠道组织结构基本恢复正常,恢复肠道黏膜免疫屏障功能,可有效降低大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。增液承气汤可通过降低体温、维护肠道组织结构正常,降低IEL及升高GC细胞数量,抑制血清炎性细胞因子的分泌而起到良好的防治作用。     

精氨酸双糖苷对脂多糖诱导的巨噬细胞分泌炎症因子的影响

为研究精氨酸双糖苷(AFG)体外的抗炎机制,以脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)作为炎症模型,用精氨酸双糖苷(AFG)的低、中、高(5、10、20 mg/L)三个剂量进行干预后,MTT法测定细胞毒性作用,Griess法测定一氧化氮(NO)生成量,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及前列腺素E2(PGE2)的分泌量。结果表明:AFG的三个不同剂量对RAW264.7细胞无抑制作用(P0.05),各浓度给药组的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2含量与LPS刺激模型组相比较都显著降低(P0.01),推想AFG的抗炎活性可能是通过抑制NO和PGE2等炎症介质释放,降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的含量而发挥了作用。     

酒精性肝病的内毒素信号通路研究

酒精性肝病(ALD)发病的重要机制在于饮酒导致肝巨噬细胞对内毒素——脂多糖(LPS)的敏感性升高,因而细胞内毒素(LPS)诱导信号相关机制在酒精肝损伤的初期和发展过程中发挥着至关重要作用。LPS被枯否细胞上的受体识别,激活下游信号通路,最终激活核转录因子(NF-κB),导致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和生长因子-β(TGF-β)等炎症细胞因子产生增加,炎症细胞因子又激活枯否细胞,产生更多细胞因子,加重肝脏损伤。     

橙皮苷抑制LPS诱导的肠上皮细胞炎性损伤及其机制研究

本研究通过建立脂多糖(LPS)诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)炎性损伤模型,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率和细胞划痕愈合率,以评估橙皮苷对LPS诱导的IEC-6细胞炎性损伤的保护作用;通过Western blot法测定NLRP3、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和IκB等蛋白的表达及炎性因子TNF-α的分泌水平,以探讨橙皮苷对IEC-6细胞炎性损伤的保护作用机制。结果表明,橙皮苷显著抑制LPS诱导的IEC-6细胞Caspase-1和IκB的激活,抑制炎性因子TNF-α的分泌,进而抑制细胞活性的降低以及迁移能力下降,从而保护IEC-6细胞免受LPS诱导的细胞炎性损伤。     

丹皮酚对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的缓解作用

旨在探究丹皮酚对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)炎性损伤的缓解作用。使用CCK-8法检测不同浓度丹皮酚对BMECs活力的影响,选用20、50和100 mg/L丹皮酚处理LPS诱导的BMECs炎性模型,并检测细胞凋亡、氧化应激因子、相关炎性因子及NF-κB关键通路蛋白表达的变化。结果显示：10～100 mg/L丹皮酚对BMECs增殖有不同程度的促进作用;不同剂量的丹皮酚可显著抑制细胞凋亡及IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)含量,抑制IκBα和p65的磷酸化水平。以上结果表明,丹皮酚能够抑制LPS诱导的BMECs的炎性损伤,其作用机制可能与NF-κB信号通路被抑制有关。