玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法,建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系,对酚抽提法、三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/丙酮沉淀法)和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析,并在相同条件下进行双向电泳比对分析,结果表明:可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富,最适合双向电泳研究;利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白,对第一向等电聚焦参数等条件,以及不同p H值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析,结果表明:采用p H值3~10的IPG预制凝胶条时,采取电压梯度上升的方式,总聚焦70 000 Vhs、上样量800μg效果最佳,采用p H值4~7的IPG预制凝胶条时,总聚焦80 000 Vhs、上样量900μg效果最佳,并且采用p H值4~7的IPG预制凝胶条相比p H值3~10的凝胶条能分离到更多的点,最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析,建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法,即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白,采用24 cm、p H值4~7的IPG干胶条,上样900μg电泳效果最佳,等点聚焦程序:500 V、1 h,1 000V、1 h,2 000 V、1 h,4 000 V、2 h,8000 V、4 h,8 000 V、80 000 Vhs,500 V保持。试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选,建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系.结果表明:使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白,更适用于双向电泳分析,结合使用pH=5~8 IPG胶条以及优化的聚焦程序,能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱.经银染显色,可检测约660个蛋白点,主要分布在p H=5~8;该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组.     

向日葵幼苗全蛋白提取及双向电泳技术体系的建立

本研究以向日葵幼苗为材料,比较TCA-丙酮提取法、Tris饱和酚提取法以及水溶法三种提取蛋白的方法,并且对双向电泳技术进行研究,初步建立向日葵幼苗蛋白的双向电泳体系。研究结果表明,用Tris饱和酚提取法提取蛋白含量最高,经蛋白定量后显示含量可达43.359 ug/u L;用不同浓度分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳,结果显示用8%分离胶可分离条带数较多,最多可分离20条蛋白条带;用不同聚焦时间以及不同上样量进行双向电泳,结果显示一向IEF聚焦时间为6 h左右,上样量为1 mg的条件较为适合,用Image Master5.0软件分析检测到蛋白点为102个。     

甜瓜叶片蛋白的提取和双向电泳体系的优化

为建立适合甜瓜(Cucumis melo L.)叶片蛋白质组分析的双向电泳体系(2-D),以甜瓜植物叶片为试验材料,比较了2种不同植物叶片蛋白的提取方法,并对双向电泳的2个重要的环节技术即聚焦参数和上样量进行了优化。结果表明：与Tirs-酚提取法相比,使用改良后的Mg/NP-40/PEG3350/TCA丙酮提取法提取叶片蛋白,经过SDS-PAGEF分析之后,所得的蛋白含量较高,Rubisco酶去除的较好,条带清晰。采用 pH 3~10,18 cm的IPG胶条进行双向电泳时,适当增加低电压聚焦时间,得到了较为清晰的2-D图谱。蛋白上样量为800 μg时,得到的蛋白点数最多,低峰度蛋白较为清晰。研究建立了适用于甜瓜叶片蛋白分析的双向电泳体系,得到了蛋白点数目多且分辨率高的双向电泳图谱。为下一步在蛋白组学水平上分析与甜瓜抗病、产量、性状等相关蛋白提供了技术支持。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

籽粒苋根系蛋白的提取与双向电泳体系的建立

本研究以籽粒苋根为试验材料,比较3种不同蛋白提取方法对蛋白质双向电泳的影响,并对其中的蛋白上样量和等电点聚焦时间进行了优化。结果表明:与酚抽提法和TCA-丙酮法相比,Tris-Hcl法提取籽粒苋根系蛋白效果较好;上样量800μg和聚焦时间70 000 Vh的条件下会得到理想的双向电泳图谱。采用优化后的条件,可以得到蛋白点数量多、背景清晰的双向电泳图谱,将为下一步镉胁迫下籽粒苋根系蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育耐镉的籽粒苋新品种提供技术资料。     

苦瓜水溶蛋白超薄等电聚焦电泳条件的优化

为了建立等电聚焦电泳进行苦瓜种子纯度及品种真实性鉴定的技术体系,本试验利用苦瓜水溶蛋白进行超薄等电聚焦电泳条件优化,结果表明,在0.15 mm超薄层凝胶和1mm普通凝胶对比中,超薄层凝胶电泳效果最好,基本无背景、条带多,节省药品;1.5h是提取苦瓜水溶蛋白的最佳时间;10μl是最佳上样量;半粒种子加蛋白提取液效果最好的是0.6ml.     

刺参体腔液蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。     

大葱花蕾总蛋白双向电泳体系的建立

为建立适合于大葱花蕾总蛋白的双向电泳体系,本研究以大葱花蕾为材料,对大葱花蕾总蛋白提取方法、IPG胶条梯度范围、上样量、等电聚焦等双向电泳的关键步骤进行优化。结果表明最适宜大葱花蕾总蛋白的双向电泳条件为:TCA-丙酮沉淀法提取大葱花蕾总蛋白,选择24 cm p H 4~7的IPG胶条,上样量800μg,按聚焦程序Ⅰ聚焦后进行双向电泳并采用考马斯亮蓝染色。采用该体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

作物叶片蛋白质组提取与酶切方法比较研究

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液（pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐）和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

香蕉枯萎病菌双向电泳体系的建立及蛋白质组学初步研究

旨在对香蕉枯萎病菌胞内蛋白的提取方法进行优化,建立菌体胞内蛋白质双向电泳体系。在原有的基础上优化菌体胞内蛋白提取方法,提取蛋白质进行双向电泳,并应用质谱技术鉴定一些蛋白质来验证提取蛋白质的质谱兼容性。通过扩大培养的方法获得足够的生物量,采用过滤法收集菌体用来提取蛋白质,涡旋振荡30 min能有效破胞,提高蛋白质提取效率。甲醇和丙酮各清洗2次能有效的清除蛋白质中的杂质,得到了高质量的蛋白质图谱,选取了10个蛋白质点进行质谱鉴定,成功的鉴定了8个蛋白质点,代表了8种蛋白质。这些结果表明提取的蛋白质和采用的胶内酶解方法具有良好的质谱兼容性,能为进一步研究不同菌体之间的差异表达蛋白质提供技术支持。     

赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析

用粳稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare),研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA₃)对盐胁迫的缓解作用;分别以H₂O (对照）,5 g L^-1 NaCl (处理I),5 g L^-1 NaCl + 100 μmol L^-1 GA₃(处理II)培养水稻种苗48 h,提取芽中的蛋白质,利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术分析了水稻蛋白质组的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,日本晴种子的萌发显著受到抑制,而GA₃能显著缓解这种抑制作用;用ImageMaster软件分析2-DE凝胶,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,在盐胁迫下斑点S1、S2和S3表达下调而斑点S4消失,在GA₃与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经MALDI-TOF MS分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S3)分别被鉴定为isoflavone reductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA₃提高水稻耐盐性途径相关。     

促芽肥对头季稻灌浆后期叶片蛋白质表达的影响

为探究促芽肥对头季稻的调控效应,以Ⅱ优1273为材料,在头季稻齐穗后18 d设置施用促芽肥和未施用促芽肥2种处理,采用比较蛋白质组学的方法和技术,并结合相关生理指标测定,分析了促芽肥对头季稻灌浆后期叶片蛋白质表达及相应生理特性的影响。不同促芽肥处理的头季稻灌浆后期叶片蛋白质经双向电泳分离后共获得了15个差异表达的蛋白质点,涉及头季稻灌浆后期叶片的光合碳同化、电子传递与光合磷酸化和抗逆抗衰老响应等,分析结果表明,头季稻后期剑叶中与光合碳同化、电子传递与光合磷酸化相关蛋白随灌浆进程呈下降趋势,施用促芽肥能明显减缓其下调幅度,从而使头季稻灌浆后期剑叶具有相对较高的叶绿素含量和净光合速率,提高了头季稻灌浆后期的干物质积累和源供应能力;还能明显提高头季稻灌浆后期剑叶中与抗性相关蛋白的表达量,从而增强稻株的活性氧清除能力,抑制功能叶的膜脂过氧化作用,延缓头季稻灌浆后期剑叶的衰老速率,从而显著提高了头季稻的结实率和产量。     

水稻灌浆期叶片蛋白质差异表达及其作用机理分析

采用双向电泳和质谱技术研究大穗型水稻“金恢809”灌浆期旗叶的蛋白质表达模式,共发现17个蛋白质发生差异表达,其中3个在灌浆前期至中期大量表达,9个在中后期大量表达,4个在后期大量表达,1个在灌浆前期和后期出现两次表达高峰。经MALDI-TOF/MS分析和数据库检索,鉴定出12个差异蛋白质,分别参与叶片的物质合成与降解,碳水化合物运输,植株抗氧化反应,激素代谢,以及细胞骨架的构建和组织成熟等生理反应。分析结果表明,核糖/半乳糖/甲基半乳糖苷运输ATP结合蛋白1在灌浆前中期参与物质向籽粒的运输;生长素响应蛋白IAA27通过调节ATPase活性影响叶片物质运输;N-乙酰谷氨酸半醛脱氢酶在灌浆末期参与叶片的多胺代谢,延缓叶片衰老;谷胱甘肽S-转移酶和Cu/Zn-超氧化物歧化酶在籽粒灌浆后期的植物解毒和防御活性氧伤害中起着重要作用。     

化感水稻PI312777响应低磷胁迫的差异蛋白质组学分析

为研究水稻响应低磷的分子机理,本研究以化感水稻PI312777为材料,应用差异蛋白质组学方法分析化感水稻PI312777根部响应低磷蛋白质组变化趋势,共鉴定11个差异蛋白质点,共分为3类：第1类,与信号转导相关蛋白质—细胞色素B5、受体激酶;第2类,与生长相关蛋白质—推定叶绿体SPR接受子、CDC2蛋白激酶、生长素转运蛋白、脯氨酸富集蛋白家族;第3类,与化感物质代谢相关蛋白质—推定水杨酸羧基转甲基酶、推定4-香豆酸辅酶A连接酶、推定细胞色素P450、苯丙氨酸解氨酶、角鲨烯单氧化酶。其中除细胞色素B5和角鲨烯单氧化酶表达丰度下调,其余蛋白质表达丰度均上调。     

甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立

选用油菜品种08127,采用TCA-丙酮提取方法,pH 4~7胶条和改进的IEF聚焦程序,得到较好的蛋白质双向电泳结果,建立了一种适合甘蓝型油菜的双向电泳体系;利用其他甘蓝型油菜品种的幼苗、叶片和茎中的蛋白检验了建立的实验体系,都能得到较好的蛋白质双向电泳结果;利用该实验体系比较甘蓝型油菜幼苗不同发育时期蛋白质双向电泳图,找到二者之间的差异点,选取部分点成功进行了质谱分析。     

橡胶树C-乳清三种蛋白提取方法双向凝胶电泳分析

摘要：C-乳清是胶乳的主要组分,就双向凝胶电泳技术而言,目前仍无有效的蛋白提取方法,这严重制约了双向凝胶电泳技术在橡胶树蛋白组分析上的应用。本文选取3种方法提取C-乳清蛋白,通过对蛋白产量和提取蛋白的双向凝胶电泳图谱分析系统评价3种方法。就蛋白产量而言,三氯乙酸/丙酮沉淀法产量最高（0.86 mg/ml C-乳清）,三氯乙酸沉淀法次之（0.72 mg/ml C-乳清）,酚提取法最低（0. 66 mg/ml C-乳清）。双向凝胶电泳图谱分析表明：酚提取法可检测到447个蛋白点,图谱背景较暗且横纵向纹理多;三氯乙酸沉淀法可检测到821个蛋白点,图谱背景居中;三氯乙酸/丙酮沉淀法可检测到1052个蛋白点,图谱背景清晰且基本无纹理。综上所述,三氯乙酸/丙酮沉淀法最适合C-乳清蛋白提取。本文首次系统评价C-乳清蛋白提取方法,必将推动橡胶树C-乳清蛋白研究发展。