马尾松萎蔫病树一种线虫分离物的鉴定

 2002年从贵阳市南明区采集到濒临死亡的马尾松标样,用改进的浅盘分离法对其进行了病原物的分离、纯化、形态学及分子生物学鉴定。结果表明,萎蔫死亡松树分离出的线虫形态特征与Mamiya报道的拟松材线虫形态特征相符。用伞滑刃线虫ITS区(internal transcribed spacer)通用引物VRF1(5'CGTAACAAGGTAGCTGTAG 3')和VRF2(5'TC-CTCCGCTAAATGATATG 3')对其基因组DNA进行PCR扩增,并对其PCR产物进行回收、克隆和测序。测序结果显示,此ITS序列与南京松材线虫的同源性为77.6%,与基因库已报道拟松材线虫序列U93554的同源性为93.5%,而与云南拟松材线虫江川种群、峨山种群和西畴种群的同源性为97.9%。通过以上形态学和分子生物学的研究,将贵阳市南明区采集到的马尾松萎蔫病树线虫分离物鉴定为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)。     

松材线虫rDNA的测序和PCR-SSCP分析

 本文为克服形态鉴定的不足,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体DNA(r DNA)的内部转录间隔区(ITS1)区(约308bp)的测序结果显示:松材线虫种内区别很小,不超过1bp;拟松材线虫种内区别较大,最大达7bp;这2种线虫的种间区别为32~39bp。根据以上测序结果,本文结合单条线虫DNA的提取技术,对14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性(PCR-SSCP)分析,结果表明PCR-SSCP分析技术可明确区分这2种线虫,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。     

松材线虫组DNA条形码筛选

本文基于Gen Bank中登录的14种松材线虫组线虫的28S、18S和ITS部分基因DNA序列,利用遗传距离法及分子生物学方法评价其各自作为松材线虫组DNA条形码序列的适用性。结果显示,28S(拟松材线虫不分亚种)、28S(拟松材线虫分亚种)、18S和ITS的基因序列种内成对遗传距离平均值分别为0.0071、0.0030、0.0007、0.0043,种间成对遗传距离平均值分别为0.0476、0.0454、0.0052、0.1556,其中28S、18S基因序列种内及种间距离存在一定程度的重叠,ITS具有一定程度的Barcoding gap。3个基因序列构建的NJ进化树显示,28S、ITS构建的系统进化树具有较高的节点支持率,可以有效将14个松材线虫组线虫分离成独立分支,而且28S可以有效鉴别出拟松材线虫的2个亚种;基于18S基因构建的进化树不能对吉拉尼伞滑刃线虫、日本冷杉伞滑刃线虫、拟松材线虫进行有效区分。因此,28S、ITS区具有一定的遗传距离间隔以及相对较高的物种识别率,可以作为松材线虫组线虫候选条形码基因。     

伞滑刃属线虫专家鉴定系统

近年来,口岸检验检疫机构多次在进境木质包装中截获活体线虫,其中多次截获到伞滑刃属的松材线虫和与其形态相似的拟松材线虫.由于线虫形体细小,种的形态差别不大,一般非专业的工作人员难以进行鉴定.     

云南省紫茎泽兰根结线虫病病原种类鉴定

为明确云南省紫茎泽兰根结线虫病的病原种类,于2019年2月在云南省澜沧县林下三七种植区采集根部带有明显根结的紫茎泽兰根系进行根结线虫分离,通过观察所分离根结线虫的2龄幼虫、雌成虫、会阴花纹特征对其进行形态学鉴定,并利用序列比对、系统发育树分析、序列特异性扩增区段(sequence characterized amplified region,SCAR)对其进行分子生物学鉴定。结果表明,该病原线虫雌成虫会阴花纹呈圆形至卵圆形,背弓中等高或低平,侧区一侧或两侧延伸形成翼状,尾区有刻点,2龄幼虫、雌成虫形态特征及形态测量指标与北方根结线虫Meloidogyne hapla相似;该病原线虫rDNA的ITS序列和mtDNA的COI序列与NCBI数据库中已登录的北方根结线虫相应序列相似度较高,分别达99.35%和98.05%以上;该病原线虫rDNA的ITS序列、mtDNA的COI序列分别以99%、100%的支持率与北方根结线虫聚为同一分支;利用SCAR特异性引物,该病原线虫均能扩增出大小约1 500 bp的基因特异性条带。综合形态学和分子生物学鉴定结果将云南省紫茎泽兰根结线虫病病原种类鉴定为北方根结线虫。     

鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定

草莓滑刃线虫是一种重要的叶和芽寄生线虫,可侵染多种重要花卉、经济作物,被列入我国检疫性有害生物名录。目前,草莓滑刃线虫的鉴定以形态学鉴定为主,但一线口岸常分离不到雌虫,鉴定困难。本研究采用形态特征和分子特征相结合的方法对草莓滑刃线虫进行鉴定:对鸢尾种苗中截获的滑刃属线虫群体雌虫、雄虫进行形态观察和形态测计并与已报道文献进行比较;PCR扩增该群体的rDNA-ITS区并测序,构建基于ITS序列的系统发育进化树;采用草莓滑刃线虫特异引物对该群体DNA样本进行扩增。结果表明:该群体与草莓滑刃线虫俄罗斯种群的测量值相接近;系统进化关系分析显示,该群体与NCBI公布的草莓滑刃线虫均处于同一进化支;采用草莓滑刃线虫特异引物PCR扩增可产生片段大小为169 bp的目的条带。     

Duplex PCR 快速检测松材线虫

利用duplex PCR技术对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)与拟松材线虫(B. mucronatus)的rDNA部分核苷酸序列扩增.根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别,设计出特异性引物,检测松材线虫的存在;在5.8S,28S保守序列区设计通用引物,检测伞滑刃线虫的存在.     

进境木质包装中豆伞滑刃线虫的鉴定

豆伞滑刃线虫由宁波出入境检验检疫局植检室验室于2004年6月首次从台湾的针叶木质包装中截获并报道以来,至今共截获17批次,分别来自韩国（6批次）、中国台湾（4批次）,日本（4批次）,印度（1批次）,马来西亚（1批次）和南非（1批次）.该线虫属松材线虫组,与拟松材线虫、松材线虫等十分接近.其主要鉴定特征是：雌虫尾圆锥形略向腹面弯曲,其腹面的边线较平直,而背面的边线明显呈圆弧形;尾尖长约2～4μm,渐细,有时呈丝状,位于腹面;雄虫交合刺较大（约36～40μm）,中间部分几乎呈直线.该线虫很容易与拟松材线虫等混淆,当形态学鉴定有困难时,ITS-RFLP方法是十分有效的辅助手段.我国大陆尚未有该线虫发生的报道.     

新加坡阔叶木包装中一种伞滑刃线虫的鉴定初报

本文对宁波口岸进境的新加坡阔叶木包装材料中截获的一种伞滑刃属线虫进行了形态学特征鉴定和分子特征分析,确定其为松材线虫组(xylophilus group)的一个新成员。该群体的主要形态鉴别特征是:雄虫交合刺呈弓形,中弧线长约23μm,基顶不显著,近末端背缘显著凹陷;雌虫有阴门盖,尾锥形,末端锐尖。该群体r DNA的ITS-RFLP图谱与所有已知松材线虫组成员的图谱有差异,基于r DNA的18S r RNA、ITS和28S r RNA-D2/D3区构建的系统发育树显示该群体与松材线虫组成员亲缘关系最近。因标本材料限制,暂作为一种未命名新种来记述报道。     

无锡口岸进境木质包装中截获的两种伞滑刃线虫的形态鉴定

松材线虫病是林业上的一种毁灭性病害.在进境木质包装检疫中,除该病的病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(steiner et buhrer)Nickel)外,还常常截获同属于伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.)的多种与之形态非常相似的线虫.本研究对进境木质包装检疫中截获的两种伞滑刃属线虫--B. rainulfi和B.conicaudatus进行了形态描述和鉴定.     

Preliminary survey of the pinewood nematode in Turkey

A survey was conducted in the northern conifer forests of Turkey in 2003 and 2004 for the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus . Wood samples were collected from declining pine trees, located in the following target areas: Düzce, Ankara, Bolu, and Artvin. Nematodes were extracted from over 310 samples and were observed and identified. B. xylophilus was not detected in any samples. Bursaphelenchus species were only found in 6% of the samples. From the B. xylophilus -group, only the species B. mucronatus was reported. Species identification was performed from morphological characters, particularly male spicules, and by molecular analysis with ITS-RFLP.     

木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测

松材线虫是进境木质包装中的重要检疫对象之一。本研究以进境木质包装中截获的12种伞滑刃属线虫,包括4种不同来源的松材线虫、3种不同来源的拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫、伯氏伞滑刃线虫及拟小刺伞滑刃线虫为材料,进行实时荧光PCR检测。结果显示,仅松材线虫可观察到明显的荧光强度变化,而其他线虫的荧光强度没有变化。通过研磨样品的方法,提取单条松材线虫的DNA,进行实时荧光PCR试验,检测成功率为100%,且不论是雄虫、雌虫或幼虫均能检测出来。该研究对于我国口岸进境木质包装中松材线虫的检测具有一定的实际意义。     

湖南省蔬菜根结线虫发生及种类鉴定

对湖南省蔬菜主产区的根结线虫病发生与危害程度进行了系统调查,结果显示蔬菜根结线虫病发生普遍,大棚蔬菜发病率高达80%,露地蔬菜发病率也在10%左右。对采自湖南省内10种蔬菜作物上的23个根结线虫种群进行了种类鉴定。采用2龄幼虫测量值、会阴花纹形态特征、PCR法及序列测定相结合的方法进行了鉴定,结果表明南方根结线虫是湖南省蔬菜根结线虫病的优势病原种群,占87%。     

食线虫真菌蠕虫埃斯特菌对植物寄生线虫的侵染特性

为评价食线虫真菌蠕虫埃斯特菌Esteya vermicola菌株NKF 13222的生防应用价值,采用2%水琼脂培养基平板接种法测定了该菌株对7种植物寄生线虫的诱引、黏附和侵染能力,并比较了其对不同线虫的侵染特性.结果显示,该菌株的菌丝对松材线虫、拟松材线虫、腐烂茎线虫和水稻干尖线虫均有诱引作用,而对南方根结线虫、禾谷孢囊线虫和穿刺短体线虫无诱引作用;菌株的粘性分生孢子对有诱引现象的4种线虫都能黏附,接种24 h后的黏附率达到82%～99%,对无诱引现象的3种线虫不能黏附;粘性分生孢子黏附虫体后对不同线虫的侵染力存在差异,接种7 d后的松材线虫死亡率可达98%,而拟松材线虫、腐烂茎线虫和水稻干尖线虫死亡率分别为43%、35%和9%.表明蠕虫埃斯特菌不仅是松材线虫的强内寄生真菌,而且对其它重要植物寄生线虫也具有一定的应用潜力.     

湖南柑橘根结线虫种类鉴定及特异性PCR检测

根结线虫病是严重危害湖南柑橘生产的主要病害,快速准确地进行病原线虫鉴定,从而制定针对性的防治措施,对柑橘产业的稳定发展至关重要。运用形态学和分子生物学技术对湖南永州地区柑橘根结线虫进行病原种类鉴定,确定其为番禺根结线虫Meloidogyne panyuensis。通过引物设计与筛选,建立了番禺根结线虫特异性PCR检测技术。结果表明,该检测方法特异性好,灵敏度高,操作简单,能有效地从多种根结线虫中特异性检测出番禺根结线虫,为柑橘病原线虫的快速检测鉴定提供技术支撑。     

应用TaqMan-MGB探针进行松材线虫的实时荧光定量检测技术研究

 松材线虫是国际公认的最重要的检疫性有害生物之一,也是我国2类检疫危险性有害生物,我国口岸多次从货物的木质包装中截获该线虫。由于松材线虫与拟松材线虫在形态上极其相似,难以区分,幼虫更无法用于鉴定。传统的形态学鉴定、生化以及其他分子技术等方法存在费时、准确度不高、灵敏度低等缺点,不易形成标准。我们设计筛选一对引物以及一条MGB探针,对松材线虫进行实时荧光PCR检测。建立了一条从1 pg到10⁴pg标准曲线,相关系数r=0.965。该检测方法省时、准确、快速、无污染。     

利用RAPD研究松材线虫和拟松材线虫亲缘关系

 用RAPD技术对18个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系基因组DNA多态性进行研究。在事先优化的条件下,用15个随机引物进行PCR扩增,一共扩增出165条谱带,多态性为91.5%。通过聚类分析,结果表明:松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的差异性,但种间差异大于种内差异,因而松材线虫和拟松材线虫应为2个独立的种。     

云南松树伞滑刃线虫种类鉴定

 2000~2001年从云南省34个县/市调查采集到病松树样本161份,鉴定出伞滑刃属线虫3个种即拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、霍夫曼伞滑刃线虫(B. hofmanni)和赫列尼库斯伞滑刃线虫(B. hellenicus)。后2种为我国新记录种,其寄主分别是华山松(Pinus armandii)和云南松(P. yunnanensis),为该2种线虫的世界新寄主记录。目前云南省没有发现松材线虫,但在16个县/市发现拟松材线虫。