MsWRKY33转录调控MsACS2影响紫花苜蓿耐盐性的研究

乙烯作为重要的植物激素之一,在植物逆境胁迫应答中发挥重要作用。ACS基因是乙烯合成过程中的关键限速酶(ACC合成酶)基因,本研究通过探究紫花苜蓿MsWRKY33转录因子对ACS基因的调控关系,为MsWRKY33参与紫花苜蓿耐盐胁迫响应的具体调控机制奠定理论基础。利用同源克隆、载体构建、酵母单杂交、酵母双杂交、qRT-PCR等技术,验证MsWRKY33对AtACS2和MsACS2的转录调控,并对盐胁迫下转基因株系中MsACS2表达模式进行分析。结果显示：MsWRKY33转录因子可以与W-box元件特异性结合,且对AtACS2和MsACS2具有转录调控作用;MsWRKY33转基因株系中MsWRKY33基因的表达量显著高于对照,转基因株系中MsACS2的表达是在MsWRKY33基因大量表达后呈上升趋势,进一步说明紫花苜蓿MsACS2基因的表达可能受MsWRKY33转录因子的正向调控。因此,紫花苜蓿受到盐胁迫时可诱导MsWRKY33的表达,MsWRKY33转录因子通过正向调控MsACS2表达,可能影响乙烯合成,从而影响紫花苜蓿的盐胁迫响应。     

紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化

NAP转录因子是植物体内特有的转录因子,在调控植物生长发育、衰老速度以及响应生物、非生物胁迫等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆紫花苜蓿NAP转录因子基因,将其命名为MsNAP(GenBank登录号:KM211498.1),MsNAP编码区长822bp,编码274个氨基酸。生物信息学分析显示:其与其他物种NAP蛋白具有较高的同源性,与蒺藜苜蓿同源性最高。荧光定量技术分析结果显示:MsNAP基因在花中表达量最高,衰老叶片中的表达水平远远高于未衰老叶片。利用DNA重组技术将MsNAP基因完整编码区连接至植物表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-MsNAP,通过农杆菌介导方法转化烟草,PCR和RT-PCR检测结果显示,成功获得了转MsNAP基因的转基因烟草,初步证明在转基因烟草中外源基因MsNAP能够转录表达,为研究MsNAP基因功能奠定了基础。     

油莎豆CeWRKY转录因子响应非生物胁迫的功能表征

油莎豆亦称油莎草,地上部分是优质牧草,地下块茎可积累大量油脂,抗逆性强、适应性广,是一种新型饲草和油料作物。WRKY是一类数量庞大的转录因子超家族,广泛参与调控植物生长发育、物质代谢和胁迫应答等生理过程。然而,有关于油莎豆WRKY家族成员及其功能知之甚少。本研究基于转录组分析,鉴定出67条油莎豆WRKY转录因子。系统发育树结果显示,油莎豆CeWRKY与拟南芥AtWRKY类似,分为I、Ⅱ、Ⅲ3个亚家族。CeWRKYs均具有典型的WRKY结构域和锌指结构域,其中7条蛋白序列的WRKY结构域存在变异,可能与WRKY成员功能歧化相关。油莎豆CeWRKY蛋白的序列长度、相对分子量、等电点等存在较大差异,均为亲水性蛋白,不含跨膜结构,亚细胞定位预测均位于细胞核。CeWRKY基因在块茎发育时期的表达模式具有时空特异性。不同CeWRKY基因参与不同逆境胁迫响应,其中CeWRKY8基因分别在干旱、盐、碱胁迫处理的油莎豆幼苗中表达谱变化显著,可能是参与油莎豆逆境胁迫响应调控的一个主效转录因子。本研究为深入解析油莎豆CeWRKY转录因子的多样性生物学功能以及介导逆境胁迫应答的分子机制奠定了基础,亦为优质高抗...     

白羊草NAC转录因子基因的克隆及表达分析

NAC转录因子是植物特有的转录因子并在植物的生长发育过程中发挥重要的作用,根据其他植物NAC转录因子基因的氨基酸保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术从白羊草(Bothriochloa ischaemum)中获得了全长cDNA,命名为BiNAC.序列分析表明,该cDNA片段全长为1549 bp,开放阅读框1125 bp,编码374个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征.进化树分析表明,该蛋白属于ATAF亚族,与高粱(Sorghum bi-color)亲缘关系最近,同源性达到94％.Real-time PCR检测结果表明,BiNAC基因在茎中的表达量最高,根中表达量最少,并且受NaC1胁迫表达上调.同时成功构建了植物表达载体pBI121-BiNAC-GUS,为进一步开展NAC基因的功能研究创造了条件.     

紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化

采用RACE技术以一段紫花苜蓿(Medicago sativa)盐诱导基因的EST(expressed sequence tag)序列为模板设计引物克隆此基因的全长序列.序列分析结果表明,该基因全长1551 bp,包含一个1230 bp的最大开放阅读框,编码409个氨基酸,包含3个RNA结合蛋白结构域(RRM domain),命名为MsRBP(GenBank accession No.JN986878.1).亚细胞定位分析表明此基因编码蛋白定位于细胞核.经同源比对和进化树分析,MsRBP基因编码的氨基酸序列与截形苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Gl ycine max)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中的某些RNA结合蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性.RT-PCR (Real-time PCR)分析结果表明,在NaCl,ABA和PEG胁迫下MsRBP基因的表达水平均上调,推测该基因可能在紫花苜蓿逆境胁迫调控中发挥重要作用.经构建植物超表达载体pBI21-MsRBP,采用农杆菌介导法对烟草(Nicotiana tabacum)进行遗传转化,获得了抗性转化再生植株.通过PCR,RT-PCR及GUS组织化学染色分析表明:MsRBP基因在烟草的基因组中能够进行转录和表达.本研究为该基因的功能鉴定与调控机制研究奠定了基础.     

紫花苜蓿bZIP转录因子MsbZIP1的克隆、表达特性和遗传转化分析

bZIP（Basic leucine zipper）是植物中一类非常重要的转录因子,参与植物从生长发育到抗性调控的多个生物学过程。为了了解紫花苜蓿（Medicago sativa）中bZIP转录因子的特性,解析紫花苜蓿MsbZIP1基因的生物学功能,从而阐述MsbZIP1基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制,本研究利用RACE技术从紫花苜蓿中获得1个MsbZIP1基因的全长cDNA,该序列全长1 176 bp,编码361个氨基酸,预测分子量为42.3 kD,等电点为6.5。分析发现,该蛋白含有bZIP家族典型的BRLZ碱性结构域和亮氨酸拉链,属于bZIP家族蛋白。进化树分析表明,该蛋白属于bZIP转录因子C亚族,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtbZIP63具有很高的同源性,推测可能具有与该类蛋白相似的功能。qRT-PCR分析表明,MsbZIP1基因对干旱、高盐、高温、低温,以及脱落酸（Abscisic acid,ABA）和生长素（Auxin,IAA）处理都有不同程度的响应,推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1,以农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,经后代筛选、扩繁和分子检测,得到7株超表达的转基因拟南芥。本研究第一次分离了紫花苜蓿C亚族bZIP转录因子,初步确定紫花苜蓿MsbZIP1基因响应多种逆境胁迫的反应,并获得了阳性转基因材料,并为进一步探索该类转录因子在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

中间锦鸡儿WRKY15基因克隆及其生物信息学分析

WRKY家族是高等植物中最大的转录因子家族之一,参与多种生物与非生物胁迫过程的调节。本研究采用PCR技术从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)中克隆了CiWRKY15基因。结合生物信息学方法对CiWRKY15基因编码的蛋白质进行理化性质、亚细胞定位、蛋白结构以及系统进化等进行预测分析。结果显示:CiWRKY15基因序列包含1005bp开放阅读框,编码335个氨基酸,含有一个典型的WRKY结构域,属于Group IId亚族。预测蛋白分子量为47.39KD,等电点为8.59,它的亚细胞定位于细胞核内。该研究结果为进一步挖掘与非生物胁迫相关的WRKY15转录因子的功能,以及为改进植物抗生物和非生物逆境的特性提供了理论依据。     

WRKY转录因子家族在植物响应逆境胁迫中的功能及应用

WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子超家族之一,广泛分布在多种植物中。WRKY转录因子家族因具有高度保守的WRKY结构域而得名,它可以结合靶基因启动子W-box顺式作用元件,从而调控多种类型靶基因的表达,在植物响应生物及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等)过程中起到重要的调控作用。本文介绍了WRKY转录因子家族的分子结构特征及作用机制,分析了其在植物响应生物和非生物胁迫过程中的生物学功能及分子调控机理,总结了WRKY转录因子家族在牧草中的研究进展,指出深入研究野生植物体内WRKY转录因子的调控机理,可能会为我们探索WRKY转录因子调控功能提供新的视角。本文为深入研究WRKY转录因子家族的调控机理,及其在牧草中发挥的生物学功能奠定理论基础和提供研究思路。     

WRKY转录因子家族在植物响应逆境胁迫中的功能及应用

WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子超家族之一,广泛分布在多种植物中.WRKY转录因子家族因具有高度保守的WRKY结构域而得名,它可以结合靶基因启动子W-box顺式作用元件,从而调控多种类型靶基因的表达,在植物响应生物及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等)过程中起到重要的调控作用.本文介绍了WRKY转录因子家族的分子结构特征及作用机制,分析了其在植物响应生物和非生物胁迫过程中的生物学功能及分子调控机理,总结了WRKY转录因子家族在牧草中的研究进展,指出深入研究野生植物体内WRKY转录因子的调控机理,可能会为我们探索WRKY转录因子调控功能提供新的视角.本文为深入研究WRKY转录因子家族的调控机理,及其在牧草中发挥的生物学功能奠定理论基础和提供研究思路.     

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X7-C-X23-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。     

紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链。通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2。通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株。     

AtPCS1基因表达载体构建与转化苜蓿的研究

扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)螯合肤合成酶(AtPCS1)全长基因;构建AtPCS1植物表达载体pBI 121-AtPCS1,进一步转化农杆菌EHA105;利用转化的农杆菌EHA105侵染甘农一号苜蓿(Medicago satiua)叶片,经过80～100 d的筛选与培养,获得57株再生转基因植...     

东方山羊豆GoGID基因表达载体构建及紫花苜蓿转化

根据已经克隆得到的东方山羊豆赤霉素受体(GoGID)基因,扩增编码区cDNA.以pBI121为基础载体,采用酶切连接法,构建植物超表达载体pBI121-GoGID.酶切鉴定表明:目的基因已经正确插入载体中,超表达载体构建成功.采用CaCl₂冻融法将重组载体转入农杆菌菌株中.以叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织培养法,转化紫花苜蓿(Medicage sativa),得到抗性苗.对载体携带的nptⅡ基因、GUS基因进行PCR检测均成阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中.同时对转基因植株进行Southern-blot及RT-PCR检测,并均得到目的条带.本研究为进一步分析GoGID基因对紫花苜蓿生物量影响奠定了基础.     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

小反刍兽疫病毒H、F基因转基因苜蓿表达载体的构建

为了有效预防小反刍兽疫,试验以pBI121为载体,PPRV-H、PPRV-F为目的基因,并插入绿色荧光蛋白(GFP)基因、MAR序列,构建5种小反刍兽疫病毒(PPRV)苜蓿表达载体。结果表明:成功构建小反刍兽疫表达载体,再将表达载体转入苜蓿,饲喂动物,选择其中免疫效果最好的表达载体,为该病的预防工作提供有效的技术支持。     

细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析

以细叶百合LpWRKY20基因为研究对象,通过荧光定量(qRT-PCR)分析该基因在不同非生物胁迫中的表达,结果表明,在不同非生物胁迫中该基因表达量存在差异。利用叶盘法将pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体转入烟草并获得转基因株系。在干旱胁迫条件下,转基因植株的表型优于野生型;转基因植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于野生型,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,具有较强的自我修复能力。干旱条件下表型及生理指标的变化均表明转基因植株具有较强的抗旱性,初步推断LpWRKY20具有抗旱的功能。     

抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究

利用基因重组技术,将木霉几丁质酶基因(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)进行融合并将其引入含bar基因的载体pAHC25中,成功构建了由Ubiquitin启动子分别驱动Chi-linker-Glu和bar的中间载体,然后将其上的Ubi-Chi-linker-Glu-nos和Ubi-bar-nos表达盒引入pBI121中,获得兼具除草剂抗性基因bar和真菌抗性基因Chi与Glu的三价植物表达载体pBIb-CG,并对烟草进行遗传转化,经PCR及Southern检测,共获得转基因烟草32株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。     

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化

胚胎晚期富集蛋白(LEA)广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。本研究利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆了一个LEA4类基因的开放阅读框(ORF),命名为MsLEA4-4。该基因编码512个氨基酸,结构分析显示MsLEA4-4包含5个重复的由11个氨基酸TAQAAKEKTQQ组成的序列特征。利用实时荧光定量PCR检测了MsLEA4-4在不同逆境下的表达量,结果显示,该基因受干旱、NaCl、Cu²⁺、Zn²⁺和外源ABA诱导表达上调,其中NaCl胁迫2 h、Cu²⁺和Zn²⁺胁迫8 h,MsLEA4-4基因表达量最高;冷胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量随处理时间的延长呈逐渐上升趋势,表明该基因可能参与了紫花苜蓿的抗逆性调控。构建植物超表达载体pCAMBIA3301-MsLEA4-4,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过草铵膦(PPT)筛选和分子检测,7株抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索MsLEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。