油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

莲草直胸跳甲小分子热激蛋白sHsp20.8基因的克隆及生物信息学分析

[目的]小分子热激蛋白基因对昆虫的生长发育和抵御环境胁迫具有重要作用,本研究在PacBio SMRT测序的基础上,进一步克隆鉴定莲草直胸跳甲(Agasicles hygrophila)小分子热激蛋白sHsp20.8基因并进行生物信息学分析。[方法]采用RT-PCR技术克隆鉴定了莲草直胸跳甲sHsp20.8基因的完整CDS;利用各种生物信息学方法对该热激蛋白的理化性质、保守结构域、亲水/疏水性、信号肽、亚细胞定位、跨膜区进行分析,并进行了二、三级结构的预测和系统发育分析。[结果]莲草直胸跳甲sHsp20.8基因完整CDS为543bp,编码180个氨基酸,分子量为20.8kDa,等电点为6.45。编码蛋白含有小分子热激蛋白保守结构域和特征基序,不含跨膜区和信号肽,定位于细胞核。系统发育分析表明小分子热激蛋白基因可以作为昆虫系统进化分析的标志基因。[结论]获得的sHsp20.8基因是sHsps家族成员,结果将为深入研究小分子热激蛋白的功能奠定理论基础。     

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

[目的]克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础.[方法]根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析.[结果]克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63.同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应.[结论]ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白.     

桃拉病毒基因组的生物信息学分析

[目的]对桃拉病毒(Taura syndrome virus,TSV)的完整基因组进行生物信息学分析。[方法]通过生物信息学方法对基因序列组成、开放阅读框、蛋白质理化性质、二级结构预测分析、蛋白跨膜结构的存在与否、蛋白信号肽存在与否以及蛋白质三级结构进行了预测分析。[结果]登录NCBI网站下载TSV(JX094350.1)10 128 bp的基因片段,经生物信息学分析,编码氨基酸3 286个,理论等电点(pI)为5.14,相对分子质量为366 443.00 Da,不稳定系数(Ⅱ)为37.76,属于稳定蛋白质;完整基因序列中包含2个开放阅读框(open reading frame,ORF);蛋白中存在跨膜结构;没有蛋白信号肽。[结论]对TSV的生物信息学分析有助于在分子水平上了解桃拉病毒的基因结构以及预测其感染机制,可为预防和治疗虾类的桃拉综合征提供有用的信息。     

意大利蜜蜂碳酸酐酶相关蛋白X的基因克隆及序列分析

[目的]对意大利蜜蜂(Apis mellifera)碳酸酐酶相关蛋白(CARPs)X的基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]通过RT-PCR扩增得到CARP X基因的cDNA序列,同时对序列进行生物信息学分析。[结果]意大利蜜蜂CARP X基因的cDNA全长972 bp,编码324个氨基酸残基,推导的氨基酸序列具有1个信号肽、2个跨膜区;预测其分子量和等电点分别为37.1 kD和7.458;该蛋白质与小蜜蜂(Apis florea)、熊蜂(Bombus impatiens)、Bombus terrestris、金小蜂(Nasonia vitripennis)、豌豆蚜虫(Acyrthosiphon pisum)的CARP X有很近的亲缘关系;聚类分析显示在昆虫体内可能具有2种不同类型的CARP X。[结论]该研究为CARPs蛋白家族的研究提供了可靠的理论基础。     

毛白杨(BJHR01)磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PLC2)基因生物信息学分析

[目的]用生物信息学手段分析、预测毛白杨PLC2基因/蛋白质的结构与特征,为该基因的克隆及功能研究提供理论参考。[方法]以PLC2基因及对应蛋白质为研究对象,利用各种网上数据库及生物信息学分析软件对其进行相关分析、预测。[结果]PLC2基因的GenBank登录号为JX424764.1,ORF长957bp,编码318个氨基酸,对应蛋白质PLC2的分子量35 999.1D,理论等电点7.07;PLC2与毛果杨（XP₀02313726.1）的同源性较高;PLC2属于PI-PLCc_GDPD_SF超家族,无O-糖基化位点,无二硫键,无跨膜区和信号肽,有16个磷酸化位点。[结论]对PLC2基因/蛋白的各级结构及功能进行预测,为下一步试验奠定基础。     

星豹蛛CYP3313A3基因克隆与生物信息学分析

[目的]星豹蛛是农业害虫的重要捕食性天敌,本课题组通过转录组测序鉴定出66条星豹蛛细胞色素P450基因,筛选分析出5条基因预测其与外源物质代谢有关,选取其中一条基因进行克隆并进行生物信息学分析。[方法]本试验采用RT-PCR技术,将提取的星豹蛛总RNA进行反转录PCR扩增,用割胶回收的扩增产物完成克隆及测序,并对CYP3313A3基因编码产物进行生物信息学分析。[结果]克隆到CYP3313A3基因序列,该基因开放阅读框为906bp,编码301个氨基酸,其相对分子质量为34. 38 kDa,等电点6. 12,原子总数4 865,分子式C_(1546)H_(2451)N_(403)O_(449)S_(16);其中正电荷残基36个,占氨基酸总数的12%,负电荷残基39个,占氨基酸总数的13%,编码蛋白存在细胞色素P450 3A亚族特征基序,其编码的蛋白的二级结构中,α螺旋为45. 18%,β折叠为14. 29%,β转角为3. 32%,无规则卷曲为37. 21%,亚细胞定位结果显示在内质网上。对其编码的蛋白进行信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽;对该蛋白的跨膜结构预测分析,结果显示该蛋白不存在跨膜结构。[结论]获得的CYP3313A3基因属于CYP3家族,本研究对今后星豹蛛细胞色素P450基因的研究提供了研究基础。     

棉花TRY基因的电子克隆

[目的]克隆棉花TRIPTYCHON(TRY)基因.[方法]利用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,克隆棉花TRY基因,并利用生物信息学分析软件,分析棉花TRY蛋白的生物信息.[结果]从徐州142无绒无絮突变体中,克隆到棉花TRY基因,其ORF(Open reading frame )全长270 bp,编码89个氨基酸.棉花TRY蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,不存在信号肽及糖基化位点,没有跨膜结构,定位于细胞核,三级结构不存在卷曲螺旋结构.[结论]在棉花中利用电子克隆技术克隆TRY基因是可行的,同时研究结果为进一步研究棉花TRY基因的功能和棉纤维发育调控机制提供理论依据.     

枳早期结瘤素样基因PtBCP1的克隆和分析

[目的]克隆枳早期结瘤素样基因PtBCP1并对其序列进行分析。[方法]以枳消减文库中的C28 EST为种子序列进行电子克隆,据此设计引物进行PCR,以获得枳早期结瘤素样基因PtBCP1的全长cDNA和DNA序列,并对获得的序列进行生物信息学分析。[结果]PtBCP1基因由2个外显子和1个内含子组成,在枳幼苗根中的表达量是叶中的140倍,该基因编码的蛋白含131个氨基酸残基,预测分子量为14.0 kD,理论等电点为8.75,具有N端信号肽和PCLD(PFMD:PF02298)功能域,但无完整的铜离子结合位点,属于早期结瘤素样蛋白。[结论]为进一步研究PtBCP1基因的生物学功能奠定了基础。     

玉米隐花色素基因cry2的电子克隆及生物信息学分析

[目的]获得玉米隐花色素基因cry2的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。[方法]通过玉米cry2基因的电子克隆和序列分析、不同物种间CRY蛋白同源性比较及进化分析研究了一种新的基因克隆方法。[结果]CRY2蛋白的分子量为78844.3,理论等电点为5.13,含有20种基本氨基酸,其中含量最高的是Leu和Ser,含量最低的是Cys;含有96个带负电荷的残基,68个带正电荷的残基,其水溶液在280nm处的消光系数约168705;其不稳定系数为54.82,脂肪系数为78.01,平均亲水系数为-0.440。预测到CRY2蛋白的二级结构中螺旋占33.4%,β折叠占7.9%,转角占58.6%。玉米CRY2蛋白与高粱、水稻、小麦、拟南芥、油菜、豌豆、烟草等植物的CRY2蛋白及玉米CRY1蛋白具有较高的一致性。玉米CRY1和CRY2蛋白均有699个氨基酸,氨基酸一致率达92.3%。[结论]电子克隆的结果为玉米cry2序列克隆提供了参考。     

禽类PRL基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]通过对PRL基因(催乳素基因)的克隆及生物信息学分析,研究该基因编码的蛋白对禽类就巢性的作用。[方法]利用原鸡PRL基因mRNA序列(NM-205466)与蓝孔雀表达序列标签(EST)数据库进行Blast检索,以及序列拼接和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得了蓝孔雀PRL基因的部分cDNA序列,并对该序列进行了生物信息学分析。[结果]获得的cDNA序列片段长度为927bp,包括完整的开放阅读框690 bp,编码229个氨基酸。系统发育树的构建发现蓝孔雀与原鸡亲缘关系比较近,与鹑次之,与火鸡亲缘关系最远。[结论]该研究结果为研究PRL蛋白的生物学功能奠定了基础。     

向日葵BADH基因部分序列的克隆与分析

[目的]为进一步利用向日葵BADH基因提供理论和实践依据。[方法]以电子克隆技术为基础,通过RT-PCR获取向日葵BADH基因的部分序列,并进行测序。[结果]通过RT-PCR获得了一段基因序列。该PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳呈现出一条长为1584bp左右的特异性条带,与预期设计的1581 bp的扩增片段相符;与电子克隆得到的相应序列比对结果表明,两者一致性高达99.22%。其编码蛋白含有与酶功能密切相关的保守氨基酸序列,与其他物种的BADH具有较高的一致性。[结论]成功克隆了向日葵BADH基因的部分序列。     

绵羊QM基因的电子克隆及其生物信息学分析

[目的]为研究绵羊QM基因的生物学功能奠定基础。[方法]利用EST数据库和电子克隆等技术克隆绵羊QM基因,通过生物信息学分析预测其序列结构,检测其在绵羊不同组织中的表达情况并分析其与其他14物种QM基因的同源性。[结果]首次成功克隆了绵羊QM基因,全长771 bp,含有1个最长为645 bp ORF,编码的蛋白分子量为24.61 kD,为碱性蛋白质。QM蛋白的二级结构含有6个α-螺旋和10个β-折叠,其余为无规卷曲。QM基因在绵羊脾脏、脑组织和骨组织中较好表达,在其余7种组织中也均有表达。QM基因在病变组织中表达量比正常组织高。在14个物种中绵羊QM基因与牛的进化距离最短。[结论]QM基因与肿瘤抑制、细胞生长、分化、发育和凋亡等有关,且有极高保守性。     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

偏肿革裥菌Lg-mnp1基因克隆及表达研究

[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据.     

基于鲁棒自适应控制策略的混合型步进电机低速伺服控制性能

针对混合型步进电机低速运行状态下脉动转矩较大的特点,应用鲁棒自适应控制策略来设计其低速伺服控制器,以实现高精度的跟踪控制性能.首先,根据混合型步进电机转矩形成的机理,揭示了其固有的脉动转矩对低速运动控制产生不利影响的动力学特征,并将它归结为两种结构不确定性,便于控制器的设计;其次,采取标准的自适应控制及其鲁棒化设计思想,借助于μ-修整策略来实现相应的控制律,确保脉动转矩的最大化补偿及伺服系统低速跟踪控制满足高性能的要求;最后对所建立的低速跟踪控制系统的性能进行了试验评估,并与作者前期的工作进行了比较,试验结果验证了其有效性与可行性.     

蜜蜂磷酸丙糖异构酶基因(AmTpi)全长cDNA的电子克隆及其验证

用电子克隆的方法获得蜜蜂(Apis mellifera)磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase,Tpi),对该基因序列进行克隆及生物信息学分析.结果表明,该基因全长1768 bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),编码247个氨基酸的蛋白;其编码的氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyxmori)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、按蚊(Anopheles gambiae)、烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)的磷酸丙糖异构酶的蛋白序列具有较高的保守性.     

淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶基因克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索利用大肠杆菌进行丝氨酸蛋白酶PL基因的克隆与表达及抗血清制备的方法。[方法]根据报道的PL蛋白基因序列设计1对引物,通过RT-PCR扩增获得PL基因片段,对重组载体进行构建、鉴定和序列分析,用表达的特异蛋白条带制备抗原,免疫家兔制备抗血清。[结果]通过RT-PCR扩增得到长约850 bp的PL基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,获得的重组子pET-22b-PL转化E.coliBL21(DE3),经最终浓度为1 mmol/L IPTG诱导37℃培养4 h,获得约31 kDa大小的重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该蛋白表达量占菌体总蛋白的60%,说明该蛋白得到了高效表达。用表达的特异蛋白条带制备的免疫家兔制备抗血清,经ELISA测定效价为1/10 000。[结论]通过基因重组可获得PL基因在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性。