应用免疫电镜技术检测植物病毒

免疫电镜技术是将免疫学与超微结构形态学相结合的一种新的检验技术。为了把此项新技术迅速应用到植物病毒检疫上去,我们做了一些工作,简报如下:一、抗血清和抗原制备:烟草坏死病毒(TNV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)和白三叶草花叶病毒(WCMV)的抗血清由农牧渔业部植检所血清室提供;马铃薯 x 病毒(PVX)和马铃薯 y 病毒(PVY)的抗血清由中国科学院微生物所提供,抗血清效价     

胶体金免疫电镜技术检测和鉴定病汁液中不同形态的植物病毒

 本文报道胶体金免疫电镜技术的建立:铜网捕获病毒后,用其稀释约200倍的同源抗血清修饰处理3~5分钟,羊抗兔IgG-金复合物标记3~5分钟,经磷钨酸负染,电镜下可见病毒粒子周围金颗粒特异性吸附,而背景上非特异性吸附很少。用此技术成功地快速检测和鉴定了病汁液中线状病毒(大麦黄花叶病毒,大麦温和花叶病毒,小麦梭条斑花叶病毒,芜菁花叶病连和马铃薯Y病毒)、棒状病毒(烟草花叶病毒、长叶车前草花叶病毒和土传小麦花叶病毒)以及球状病毒(水稻矮缩病毒、黄瓜花叶病毒和大麦黄矮病毒)。用0.5M PBSpH7.0制备病汁液,可大幅度提高同源抗血清对黄瓜花叶病毒的捕获能力。     

甘蔗花叶病毒CI蛋白在玉米韧皮部细胞中的免疫定位

为探讨甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)CI基因的功能,对CI蛋白进行了免疫定位.利用RT-PCR方法,扩增甘蔗花叶病毒北京株系(SCMV Beijing isolate,SCMV-BJ)CI基因部分片段,将其连接到表达载体pET-28a上,重组质粒pETCIF1导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中.SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CI基因获得了高效表达.将融合蛋白纯化后免疫兔子获得特异性较高的抗血清,利用该抗血清,对健康玉米和受病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,在茎和叶脉韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒.     

免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用和进展

早在1941年 Anderson 和 Stanley 曾在电镜下,观察到烟草花叶病毒(TMV)抗血清与抗原结合的络合物,然而免疫电镜技术直接应用于植物病毒诊断和研究,还是从本世纪六十年代开始,七十年代以来才发展较快。由于免疫电镜取样很省,     

南京地区进口种苗病毒病的检测

我们在1988年5～10月分别对南京地区8个引种单位进行了植物生长季节病毒病调查和取样检测,共调查了48种植物,取了136份样品,其中进口植物26种,样品82份。使用农业部植物检疫实验所研制的抗血清,检出了烟草花叶病毒(TMV)、番茄黑环病毒(TBRV)、葡萄     

用A蛋白免疫电镜快速检测几种蔬菜作物的两种杆状病毒

 应用A蛋白免疫电镜技术对几种蔬菜作物的长叶车前草花叶病毒(RMV)、烟草花叶病毒(TMV)的检测比常规的电镜负染技术至少要灵敏近10,000倍,比普通的免疫电镜技术要灵敏10~100倍,抗血清浓度稀释至400,000倍,病毒粗提液稀释到1,000,000倍或病毒提纯液浓度为2.5×10^-7 mg/ml时均能观察到病毒粒子。同时由于抗体分子能特异性地结合到病毒粒子表面,能够很容易地区分不同的病毒种类。
应用此项技术作者检测了杭州地区几种常见的蔬菜病毒病,对大白菜(Brassica campestris L.),蕃茄(Lycopersicum esculentum Mill),榨菜(Brassica juncea var.tsatsai Mao),雪里(Brassicajuncea var.multiceps Tsen et Lee)等作物发病期的叶或果的浸提液用A蛋白免疫电镜进行快速检测,结果在大白菜,番茄等病株上检测到较多的病毒粒子,且大多能被RMV抗血清修饰,同时在番茄病株检测到的少量病毒粒子亦能被TMV抗血清修饰,而榨菜及雪里等病株上检测到的病毒粒子很少能被RMV及TMV抗血清所修饰,另外,病毒粒子的含量以番茄病果中为最高,要比其它几种蔬菜作物叶子中高约10~30倍。     

用聚乙二醇沉淀法粗提纯植物病毒

南方菜豆花叶病毒(SBMV)经两次PEG沉淀提纯的粗提纯病毒制剂和经密度梯度提纯的精提纯病毒制剂,在电镜下均能观察到大量的球状病毒,且均具有典型的核蛋白吸收图谱。两种方法提纯的病毒制剂免疫家兔,都能制备出效价高达1/1024(免疫双扩散法)的抗血清。此外,烟草花叶病毒(TMV),黄瓜花叶病毒(CMV),马铃薯Y病毒(N株系)(PVY~N),苜蓿花叶病毒(AMV)和烟草坏死病毒(TNV)用PEG沉淀法粗提纯病毒也均获得良好的效果。     

甘肃省18种药用植物病毒病调查及2种病毒病的鉴定

2012年6月至2013年9月对甘肃省宕昌县、漳县、岷县、渭源县、陇西县、临洮县等地区种植的具有疑似病毒病症状的半夏等18种药用植物进行调查及采样。采用黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、芜菁花叶病毒(TuMV)等7种双抗体夹心免疫酶联检测(DAS-ELISA)试剂盒初检, 并对CMV和ToMV采用反转录PCR(RT-PCR)方法复检, 结果表明, 半夏、掌叶大黄和红花3种药用植物受到黄瓜花叶病毒(CMV)侵染; 马兜铃、土贝母及当归3种植物受到番茄花叶病毒(ToMV)侵染; 样品中未检测到上述其他病毒种类, 其余12种病毒样品的病原尚未确定。本研究为国内首次报道CMV病毒侵染掌叶大黄、红花, ToMV病毒侵染马兜铃、当归和土贝母。此研究为防治上述病毒病提供了依据。     

芝麻坏死花叶病毒的鉴定

 自武昌芝麻坏死花叶病株得到1个病毒分离物,根据该分离物生物学特性、粒体形状、血清学性质、外壳蛋白分子量和核酸组分、大小,明确为自然侵染芝麻的一种新病毒,定名为芝麻坏死花叶病毒(Sesame necrotic mosaic virus,SNMV)。在人工接种7科38种植物中,SNMV侵染6科23种;体外稳定性状:稀释限点10^-4~10^-5,致死温度80~85℃,体外存活期限40d;病毒可通过土壤和接触传播。SNMV病毒粒体球状,表面有粒状突起,直径约32nm。制备病毒抗血清用琼脂双扩散方法测定效价为1:128。SNMV和红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)、甜三叶草坏死花叶病毒(SCNMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和花生矮化病毒(PSV)抗血清没有反应。病毒外壳蛋白亚基分子量为38 100道尔顿;核酸1个组分,大小约4700nt,另含RNA片段,大小约600nt,可能为卫星RNA。依据上述病毒特性,SNMV可能归属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)。     

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测

 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV),通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,通过优化引物和模板浓度,摸索扩增参数,在一个体系中成功对5种病毒复合侵染的烟草材料进行多重RT-PCR扩增,得到237、273、347、456和547 bp共5条特异性条带,建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明,多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒,并且灵敏度高。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测几种食用菌蛋白抗烟草花叶病毒的活性

根据烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白(CP)RNA的特异性序列设计TaqMan荧光探针及其引物,利用实时荧光定量RT-PCR检测食用菌蛋白抗TMV的活性。经食用菌蛋白处理后,TMV病毒汁液中TMV的RNA浓度下降了22.02%~87.93%,传统生物学测定的食用菌蛋白抗TMV的平均枯斑抑制率为10.88%～83.97%;相关性分析表明,实时荧光定量RT-PCR测定的病毒RNA浓度的下降与传统生物学方法测定的平均枯斑抑制率之间呈正相关(r=0.818 8),具有较好的一致性。利用实时荧光定量RT-PCR检测蛋白抗烟草花叶病毒活性的方法,具有特异性好、快速、简便、重复性高的特点,适合于蛋白抗烟草花叶病毒活性的痕量快速高效检测。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麦花叶病毒科Bromoviridae黄瓜花叶病毒属Cucumovirus的典型种。该病毒寄主范围广泛，能侵染85科365属1000多种植物。CMV除能单独侵染寄主植物外，还经常与TMV、PVY等复合侵染，给病害的田间调查和防治造成了困难。作者从山东青州的发病烟草植株上分离到了一个CMV青州分离物（命名为CMV-QZ），利用RT-PCR的方法克隆到了其外壳蛋白（coat protein，CP）基因，利用原核表达的CMV CP制备了抗血清，以期为CMV的准确快速检测提供依据。     

侵染西瓜的小西葫芦花叶病毒的生物学特性鉴定

西瓜病毒病是制约西瓜产量及品质的顽疾.据报道,该病害造成的经济损失达到30%～50%.1981～1999年皖、苏、鲁、豫西瓜的病毒病曾几次大发生.危害西瓜的病毒病有西瓜花叶病毒1号(WMV-1)、西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、南瓜花叶病毒(SqMV)等32种[1].小西葫芦花叶病毒(ZYMV)是侵染葫芦科的主要病毒之一,1973年首次在意大利北部发现此病毒,至今已成为一个全球性的植物病毒[2].笔者对ZYMV合肥分离物的生物学特性进行了研究.     

北京菜豆(Phaseolus Vulgaris)上的一种新病毒—和性黄色花叶病毒

 从北京郊区患有类似花叶病害的菜豆株上分离到一种线条状病毒(长约700至750nm)并于1983至1986年间加以研究。在温室内接种可以侵染菜豆、蚕豆、豌豆、大豆、决明、苋色藜及昆诺藜而不能侵染被接种的任何茄科植物.同标准的菜豆普遍花叶病毒(BCMV)相比,它不侵染茄科植物例如黄花烟(Nicotiana rustica)和矮牵牛(Petunia hybrida)在菜豆叶上也不产生坏死枯斑.此外它能侵染蚕豆、大豆、豌豆及决明而BCMV则不能.BCMV能侵染豇豆而这一分离物则不能.此分离物的物理性状为:钝化温度=56-580℃(十分钟),硫释限点=10^-3至10^-4,180℃下存治期为3天,A260/280=1.12.菜豆受侵叶组织易用光学显微镜观察到内含体包括一种片层叠合体.在电镜下超薄切片中可以看到风轮状体.极易用汁液摩接及用桃蚜(Myzus persic(接种.此病毒的衣壳蛋白亚基的分子量经测定为32,000道尔顿.此病毒与下列病毒即菜豆普通花叶病毒,菜豆黄色花叶病毒,黑眼豇豆花叶病毒,豌豆种传花叶病毒,三叶草黄脉病毒,莴苣花叶病毒及甜菜花叶病毒的抗血清均无反应.由于它在菜豆的"一窝猴"品种的叶片上产生沿脉黄色小点,因此认为这是一种新的独立的病毒,称之为菜豆和性黄色花叶病毒.     

番茄花叶病毒番茄分离物与烟草花叶病毒蚕豆分离物生物学、血清学比较及PCR特异性检测

 对番茄花叶病毒番茄分离物(ToMV-To-S1)和烟草花叶病毒蚕豆分离物(TMV-B935A)进行了生物学和血清学比较。人工接种6科20种植物,这两个分离物均能侵染其中的3科14种植物,但在普通烟(白肋烟、黄苗榆)上的症状差异较大,前者在这些植物上引起局部症状,后者为系统症状。在琼脂双扩散试验中,两者与ToMV-To-S1抗血清和4种TMV抗血清均形成沉淀线,但沉淀线之间产生刺角,说明ToMV-To-S1和TMV-B935A虽有血清关系,但亦有差异。胶内交叉吸附试验也证明两者之间有血清学差异。根据已报道的ToMV-L株系和TMVU1株系CP基因的3'端非编码区序列设计了ToMV和TMV特异引物,采用PCR方法,这些引物能够特异性的检测区分ToMV-To-S1和TMV-B935A。     

番茄花叶病毒番茄分离物与烟草花叶病毒蚕豆分离物生物学、血清学比较及PCR特异性检测

 对番茄花叶病毒番茄分离物(ToMV-To-S1)和烟草花叶病毒蚕豆分离物(TMV-B935A)进行了生物学和血清学比较。人工接种6科20种植物,这两个分离物均能侵染其中的3科14种植物,但在普通烟(白肋烟、黄苗榆)上的症状差异较大,前者在这些植物上引起局部症状,后者为系统症状。在琼脂双扩散试验中,两者与ToMV-To-S1抗血清和4种TMV抗血清均形成沉淀线,但沉淀线之间产生刺角,说明ToMV-To-S1和TMV-B935A虽有血清关系,但亦有差异。胶内交叉吸附试验也证明两者之间有血清学差异。根据已报道的ToMV-L株系和TMVU1株系CP基因的3'端非编码区序列设计了ToMV和TMV特异引物,采用PCR方法,这些引物能够特异性的检测区分ToMV-To-S1和TMV-B935A。     

取代甲醛肟羧酸酯的合成及生物活性研究(V) —拟除虫菊酸4-二甲(乙) 氨基苯甲醛肟酯抗植物病毒活性

植物病毒对寄主植物的危害极大 ,素有“植物癌症”之称 [1 ] 。近年来寻找和筛选抗植物病毒药物的研究一直颇受关注 ,虽然已涌现出多种化学药物 ,但防治效果仍不理想 [2 ]。作者前文 [3]报道了 1 2个新拟除虫菊酸肟酯类化学物 3的合成 ,并对其杀虫杀菌活性进行了讨论 ,本文将对这些化合物的抗植物病毒活性作简要报道。1　材料与方法1 .1　供试毒源烟草花叶病毒 ( TMV) ;黄瓜花叶病毒 ( CMV) ;马铃薯 X病毒 ( PVX) ;马铃薯 Y病毒 ( PVY)。1 .2　供试植物三生烟 ( Nicotiana tabacum cv,“Samsum”) :TMV系统寄主 ,用于繁殖毒源 ;珊西…     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

与BBWV 2胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

植物病毒侵入寄主后在细胞中复制增殖,通过胞间连丝短距离胞间运动和维管束长距离转运到达植株各个部位,形成系统性侵染。以烟草花叶病毒(TMV)为代表的运动蛋白MP/RNA结合体形式和以豇豆花叶病毒(CPMV)为代表的管状结构形式是2种最主要的胞间运动形式。有关蚕豆萎焉病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBMV 2)所在蚕豆病毒属(Fabavirus)的胞间运动机理迄今尚不明了。对BBWV 2中国分离物B935侵染的豌豆和蚕豆进行了详细的超微结构观察,得到了一些涉及病毒胞间运动和长距离转运的超微结构证据。