利用农杆菌介导的共转化法获得含双Bt基因转基因水稻

利用农杆菌介导的共转化法,将分别携带不同Bt抗虫基因Cry1C*和Cry2A*的两个植物表达载体同时导入吉林省主栽超级粳稻品种吉粳88中,获得598株草丁膦(Basta)抗性独立转化植株。以Cry1C*和Cry2A*特异性引物对独立转化植株进行双引物PCR扩增,结果得到35株Cry1C*和Cry2A*基因双阳性植株,双基因共转化率为6.28%。以目的基因Cry1C*和Cry2A*为探针进行Southern blot分析,获得3个双基因单拷贝株系。利用RT-PCR检测Bt基因在这3个株系中的mRNA表达情况,结果表明两个Bt基因在转录水平上同时得到了有效表达。     

2种新的转双价基因棉种子越冬能力研究

以非转基因常规棉赣棉11号为对照,用当年的种子进行年前与年后室内发芽试验,研究转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉和转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉种子的越冬能力,结果表明:室内常温越冬后,转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉的发芽势及发芽率并未衰减,反而有所增强,分别提高0.75和1.00个百分点,转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的发芽势及发芽率都提高1.00个百分点;而常规棉(CK)的发芽势及发芽率分别衰减2.75和1.00个百分点,这说明转双价抗虫基因棉及转双价抗虫抗除草剂基因棉种子的越冬竞争能力较强。此外,3个供试棉花品种的种子野外越冬均不能发芽和生苗,野外播种无越冬能力。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

青杨双价抗虫基因转化系统研究

利用农杆菌介导法，对青杨进行含部分改造的Bt CryAc基因(Bt基因)和慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因A的双价抗虫基因转化，确定了适于青杨的遗传转化系统。经含Km40mg/L的生根培养基的筛选，获得了青杨转基因植株。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为研究

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种,采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行为进行了研究.连续三代的研究结果表明Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株(T01,T02,T03,T05,T06,T07,T08)的基因组中,并稳定地遗传给后代.纯合转基因株系杂交分析表明,在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的,T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白基因整合位点是同源染色体的不同座位,而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白基因整合位点是在非同源染色体上.     

转双Bt基因欧洲黑杨毒蛋白季节变化及抗虫性分析

利用美国白蛾和柳蓝叶甲对转Cry1Ac-Cry3A-BADH-MtlD基因欧洲黑杨进行抗虫性筛选,对筛选出具有双高抗虫性的5个转基因株系进行外源基因PCR检测,利用酶联免疫吸附法(ELISA)对5个转基因株系叶片Bt毒蛋白含量进行检测,分析5个转基因株系叶片中2个Bt基因在生长季节不同时期的表达情况,对其差异进行分析;检测转基因株系对不同虫龄美国白蛾和柳蓝叶甲的抗性。结果表明:(1)初步筛选出5个高抗虫性的转基因株系1号、7号、9号、11号和12号,其对美国白蛾和柳蓝叶甲1龄幼虫致死率均超过90%以上;(2)PCR检测结果表明5个转基因株系叶片中均检测Cry1Ac-Cry3A基因条带,而对照则未检测到,证明外源基因均已插入到受体杨树基因组中;(3)转基因株系均检测到Bt毒蛋白,而对照则未检测出。从6月至10月,转基因株系叶片中Cry1Ac毒蛋白的表达量总体呈上升趋势,但在6月、7月略有下降;Cry3A毒蛋白的表达量从6月至10月总体呈下降趋势;(4)美国白蛾和柳蓝叶甲随虫龄的增大致死率呈下降趋势,不同转基因株系间抗虫性存在显著差异。     

利用分子标记辅助选择培育转 Bt基因抗虫水稻

为培育转Bt基因抗虫水稻品种材料,以传统杂交的方法将3个Bt明恢63中的Bt基因cry1C*、cry2A*和cry1Ac/Ab,转育到水稻品种秀水123、湘晴、旱恢3号和沪旱1B中;以回交二代自交三代（BC2F3）水稻叶片为材料,利用分子标记辅助选择、田间除草剂筛选和试纸条检测方法,以获得新型转Bt基因株系。并在全生育期实行除不喷施农药外的正常田间管理的转基因植株的田间抗虫鉴定方法筛选出抗虫性良好、农艺性状优良的株系,为后续抗虫育种提供材料。 BC2 F3代PCR检测及试纸条检测的结果显示分别获得cry1C*和cry2A*基因的沪旱1B、秀水123和湘晴的纯合株系。同时,在田间自然诱发虫害条件下,转基因株系对稻纵卷叶螟虫表现出强抗性。     

抗虫基因cry1Ab／Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。 Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

Cry1 Ac基因组织特异表达载体构建及水稻遗传转化

为了提高转基因抗虫水稻的生物安全性,构建了由组织特异性启动子序列RSP1、RSP2及组成型启动子35S带动Bt基因Cry1Ac的双元载体pCAM RSP1 Cry1A(c)、pCAM RSP2 Cry1A(c)及pCAM 35S Cry1A(c),并通过农杆菌EHA105介导对两个水稻品种"秀水11"和"秀水63"进行了遗传转化。"秀水11"和"秀水63"的平均转化率分别为72 9%和83 2%,经抗性愈伤组织的分化培养两个品种分别获得346和448株再生植株,其中PCR检测阳性株数分别为295和414。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

Penetration of a Single Domain of Bacillus thuringiensis Cry1Ie-Domain I to a Lipid Membrane In vitro

Domain I of the activated Crystal protein from Bacillus thuringiensis has a seven α-helix bundle structure, which is responsible for membrane channel formation in its insecticidal mechanism. Cry1Ie is toxic to Asian corn borer, Ostrinia furnacalis (Guenée), and plays important roles in insect biological control. The domain I from Cry1Ie has been expressed and purified in its normal conformation, as embedded in the full length homologous toxin structure. The membrane insertion ability of this single domain was compared with the full length homologous toxin using a monolayer insertion experiment. The results indicated that the Cry1Ie-domain I had the ability to insert into the lipid monolayer, and this ability is greater than that of the IE648 toxin. However, the state of insertion is not stable and remains for only a short period of time. The Cry1Ie-domain I plays no role in receptor binding as it had a nonspecific binding with the brush border membrane vesicles of the Asian corn borer.     

Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展

球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericuss,Bs)Mtx1和苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis israelens,Bti)Cry4Ba是主要的杀蚊毒蛋白。通过对Mtx1毒蛋白杀蚊的作用机理,Cry4Ba毒蛋白的结构与作用机理的介绍,综述Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展,并对Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白的未来研究进行了思考。     

Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因Bt-r3在大肠杆菌中的克隆和表达及特性分析

根据二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab的受体基因Bt-r3的cDNA序列设计特异引物,扩增得到编码Bt-R3蛋白胞外部分的目的片段(约4500bp).将目的基因酶切克隆到质粒载体prcHis-TOPO上,再将该质粒导入到感受态细胞TOP 10,经IPTG诱导、得到约为160 kD的表达蛋白.经Western印迹鉴定,结果表明表达产物能有效地结合Bt毒蛋白Cry1Ab,从而确认Bt-r3是Cry1Ab的受体基因.它们的结合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中.     

干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响

利用已公布的水稻Cry1a与Cry1b基因序列设计引物,PCR扩增基因部分片段,构建了一个包含2个隐花色素基因片段的ihpRNA表达载体pSC1301-347-Cry1aCry1b,并通过农杆菌介导转化水稻,以期同时导致这2个基因功能缺失.根据转基因植株主要农艺性状的表现,初步分析了Cry1a与Cry1b对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期推迟16 d,株高增加明显,粒型显著变长,而其他所观察的性状无明显改变.     

Studies on Rapid Quantitative Analysis of Bt Toxin by Using Envirologix Kits in Transgenic Rice

Investigations were done on the usefulness of Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac Plate kits for quantitative analysis of Bt toxin content in transgenic rice grains. Two transgenic rice lines: Kemingdao 1 (KMD1) and Kemingdao 2 (KMD2), transformed with a cry1Ab gene, and their parental variety, cv.Xiushui 11, were used as positive and negative samples. Results showed that the correlation coefficients as high as 0. 985 - 0. 998, significant at probability level of 0.05 or 0.01, were obtained for linear regression equations by using the appended calibrators of the kits. No significant differences were detected for values of same rice sample obtained from different trials or by using different lots of the product (kit). The detectable Bt toxin content by this method could be as low as 0.5 ng/g. The Envirologix Kit could be useful for rapid quantitative detection of Bt toxin in rice grains because of its preciseness, simplicity and time saving.     

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac试剂盒快速测定转基因水稻Bt杀虫蛋白含量的研究

 用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两个转 cry1Ab的水稻品系克螟稻 1号 ( KMD1)、克螟稻 2号 ( KMD2 ) ,及未转化的对照品种秀水 11米粒中的 Bt杀虫蛋白含量。结果表明 ,该试剂盒标样制作的标准曲线相关系数为 0 .985～ 0 .998,在 0 .0 5或 0 .0 1水平上显著。同批次试剂盒的不同试验及不同批次试剂盒的测定值均差异不显著。最低检测剂量达 0 .5 ng/g,每次测试时间比 Western dot blotting方法缩短约 2 h。试验表明 ,该试剂盒是定量检测转基因水稻 Bt毒蛋白表达的一种理想产品     

转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性分析

为了对转基因抗虫玉米转育株 Bt 蛋白的表达特性进行分析,用Cry1Ab/Cry1Ac 平板试剂盒定量检测了3种含 Bt 基因的玉米回交后代品系 BC₁F₁ ( HZ3152、HZ3342、HC0142 ) 在相同生长时期不同组织和不同生长时期相同组织中 Bt 蛋白的表达量。结果表明,在乳熟期 BC₁F₁ 不同组织中 Bt 蛋白表达含量的高低顺序为: 叶片 ＞胚乳＞花丝＞种子苞叶;在BC₁F₁不同的生长发育阶段 ( 苗期、抽丝期和乳熟期 ),叶片中 Bt 蛋白的含量随生育期的推移呈明显先上升后下降趋势, Bt 蛋白含量在抽丝期达到最大,之后又开始下降;苗期 ( HC0142、HZ3152、HZ3342） Bt 蛋白的含量 (4.16、3.75和3.72 μg·g^-1 ) 和乳熟期 (5.56、4.58和4.79 μg·g^-1 ) 的含量分别是抽丝期 (6.05、5.36和5.50 μg·g^-1) 的 68%、69%、67% 和91%、85%、87%。一般在玉米生长后期 Bt 蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。该研究表明 Bt 蛋白在玉米回交后代中可以稳定表达,对 Bt 的相关研究为转基因育种等提供了参考依据。     

Bt抗虫水稻转育后代两种筛选方法的比较

[目的]通过比较分子标记辅助选择和除草剂抗性筛选两种检测方法的优缺点,为快速、准确、经济有效地选择抗螟虫水稻转育后代提供依据.[方法]用分子标记检测和除草剂抗性筛选两种方法,对不同组合的抗螟虫转育后代进行筛选,同时采用ELISA检测方法对筛选的抗性株系测定杀虫蛋白含量,比较两种筛选方法的准确性.[结果]在以T1C-19为供体亲本的4个组合169个单株中,两种筛选方法的符合率达到98.2%;而以T2A-1为供体亲本的3个组合141个单株中,两种筛选方法的符合率达到98.6%.在随机选择的经两种筛选方法鉴定均为阳性的144个单株中,均含有对应Bt抗虫基因的杀虫蛋白表达量,与亲本T1C-19、T2A-21相比,Bt抗虫水稻转育后代中个别单株的Bt蛋白含量出现大幅度下降或上升的现象.[结论]分子标记检测和除草剂抗性筛选对抗螟虫水稻转育后代的选择均有很高的准确性:分子标记检测准确可靠,且不受环境影响,但费用相对高;除草剂抗性筛选法耗费低、简便易行,但易受雨天影响.在筛选的过程中可根据现有的条件做出适宜选择.