兰州大尾羊H-FABP基因荧光定量PCR检测方法的研究

通过对兰州大尾羊尾部、大网膜、肝脏、肾周脂肪组织中的总RNA提取,反转录获得总cDNA样品,结合PCR技术,建立了SYBR荧光定量PCR法检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因mRNA在不同组织中相对表达量的试验方法,并进行批内、批间重复性检验。结果表明,H-FABP和18S基因标准曲线回归方程分别为CtH-FABP =-3.24375x+38.34230和Ct18S=-3.33137x+33.4573,相关系数（r2）分别为0.9964和0.9992,扩增效率分别为103%和99%;批内、批间重复性测定的变异系数分别为小于1.8%和10%;说明该方法灵敏度高、特异性强、准确可靠、重复性好,是实时荧光定量PCR检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白基因mRNA表达量的有效方法。     

兰州大尾羊解偶联蛋白3(UCP3)基因荧光定量PCR检测方法的研究

试验通过提取兰州大尾羊不同组织中总RNA,反转录获得总cDNA样品,建立了用SYBR荧光定量PCR法检测兰州大尾羊解偶联蛋白(UCP3)基因mRNA在不同组织中的相对表达量的检测方法,并进行批内、批间重复性检验。结果表明:UCP3和GADPH基因标准曲线回归方程分别为CtUCP3=-3.2343x+41.6198和CtGADPH=-3.2851x+38.0344,相关系数(r2)分别为0.9958和0.9986,扩增效率分别为103%和97%;批内、批间重复性测定的变异系数分别为小于1.4%和10%。     

不同群体肉羊背最长肌中H-FABP mRNA表达的比较研究

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因是影响肌间脂肪(IMF)含量进而调控肉品质的的主要候选基因。试验以乌珠穆沁羊以及以南非肉用美利奴羊、东北细毛羊、小尾寒羊、杜泊羊为亲本获得的3种杂交羊(杜寒杂DS组,南寒杂SS组,东南杂NS组)为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术测定了背最长肌中H-FABP mRNA的相对表达量,比较该基因在不同群体中的表达差异。结果表明:H-FABP在不同品种肉羊背最长肌中均有表达,但不同群体间差异不显著(P>0.05)。以乌珠穆沁羊H-FABP mRNA表达量为参照,H-FABP mRNA在杜寒杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的3倍,南寒杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的0.5倍,东南杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的1.4倍。H-FABP可能是调控纯种地方绵羊及杂交肉羊肌肉肉质性状的候选基因。     

绵羊H-FABP基因不同组织表达差异研究

为了检测心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因在绵羊不同组织的表达差异,试验采用实时荧光定量PCR法检测绵羊H-FABP基因在不同组织中的表达情况。结果表明:H-FABP基因在不同的组织中表达量不同,由高到低依次为腿部半腱肌、背最长肌、心脏、肾脏、脾脏、十二指肠、肝脏、肺脏。     

徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备

旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。     

巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因表达的发育性变化及其肌内脂肪含量研究

为探讨心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)和脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,A-FABP)基因与巨型玫瑰冠鸡生长发育及肌内脂肪含量(IMF)的关系,研究H-FABP、A-FABP基因对巨型玫瑰冠鸡IMF含量和腹脂沉积的作用机制,本试验采集了巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡在不同周龄(2、4、6、8、10、12周龄)的腹脂、心肌、胸肌、腿肌组织样品共480份,采用实时荧光定量PCR对巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡不同生长阶段组织中H-FABP、A-FABP基因mRNA表达量进行了检测,并采用索氏浸提法测定了两种鸡12周龄的胸肌与腿肌的IMF含量。结果表明,巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡的H-FABP、A-FABP基因mRNA在腹脂、心肌、胸肌和腿肌组织中均有不同程度的表达,且两种鸡H-FABP基因mRNA在心肌组织中高度表达,在脂肪组织中表达量较低,在胸肌、腿肌组织中中度表达,而A-FABP基因相反,推测H-FABP基因主要在肌肉组织中表达,而A-FABP基因主要在脂肪组织中表达。良凤花鸡生长速度高于巨型玫瑰冠鸡;巨型玫瑰冠鸡的腹脂率均低于同性别的良凤花鸡,但胸肌、腿肌的IMF均高于同性别的良凤花鸡,表明巨型玫瑰冠鸡的肉品质优于良凤花鸡。本试验结果为巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因分子选育奠定了基础。     

巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因表达的发育性变化及其肌内脂肪含量研究

为探讨心脏型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）和脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein，A-FABP）基因与巨型玫瑰冠鸡生长发育及肌内脂肪含量（IMF）的关系，研究H-FABP、A-FABP基因对巨型玫瑰冠鸡IMF含量和腹脂沉积的作用机制，本试验采集了巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡在不同周龄（2、4、6、8、10、12周龄）的腹脂、心肌、胸肌、腿肌组织样品共480份，采用实时荧光定量PCR对巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡不同生长阶段组织中H-FABP、A-FABP基因mRNA表达量进行了检测，并采用索氏浸提法测定了两种鸡12周龄的胸肌与腿肌的IMF含量。结果表明，巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡的H-FABP、A-FABP基因mRNA在腹脂、心肌、胸肌和腿肌组织中均有不同程度的表达，且两种鸡H-FABP基因mRNA在心肌组织中高度表达，在脂肪组织中表达量较低，在胸肌、腿肌组织中中度表达，而A-FABP基因相反，推测H-FABP基因主要在肌肉组织中表达，而A-FABP基因主要在脂肪组织中表达。良凤花鸡生长速度高于巨型玫瑰冠鸡；巨型玫瑰冠鸡的腹脂率均低于同性别的良凤花鸡，但胸肌、腿肌的IMF均高于同性别的良凤花鸡，表明巨型玫瑰冠鸡的肉品质优于良凤花鸡。本试验结果为巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因分子选育奠定了基础。     

隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较

为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S r DNA序列的套式PCR方法进行了比较。结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S r DNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了三种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,三种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显著高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率。上述结果表明,三种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测。     

广灵大尾羊TP53INP2基因的克隆、生物信息学分析及其在不同脂肪组织中的表达研究

本研究旨在克隆绵羊TP53INP2基因CDS区,分析基因mRNA序列及其编码蛋白的性质,并检测该基因在5种脂肪组织中的表达情况.选择广灵大尾羊为研究对象,PCR扩增TP53INP2基因的CDS区,生物信息学软件分析其性质,实时荧光定量PCR检测脂肪组织表达量.结果显示:绵羊TP53INP2基因CDS全长为675 bp,...     

家兔H-FABP基因Real-time PCR方法的建立

本研究根据Gen Bank上登录的家兔H-FABP基因CDS序列设计保守引物,建立了基于SYBRGreen Ⅰ染料技术的real-time PCR方法。结果表明:所构建的标准曲线回归方程为CtH-FABP=-3.151x+39.647,相关系数(r2)为0.999,批内、批间重复性测定的变异系数分别小于5.13%和7.64%,说明该方法具有快速、灵敏、特异性高、重复性好等优点。这一方法的建立为进一步研究H-FABP基因在不同品种家兔表达奠定了基础。