耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用

为寻求具有耐热性能的木聚糖酶,笔者以嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)DSM3960的基因组为模板,克隆得到木聚糖酶基因xyn B-DT,该基因全长1 083 bp,共编码361个氨基酸,蛋白的理论分子量约为40ku。通过NCBI数据库比对发现该基因编码的蛋白质属于糖苷水解酶G11家族。实现大肠杆菌异源表达重组木聚糖酶Xyn B-DT,通过IPTG诱导,酶活达到30.6 U/mL。该重组木聚糖酶的最适温度为85℃,在60~80℃范围内均有较好温度稳定性,在60℃条件下保温2 h,酶活维持在90%以上,在90℃下保温2 h,酶活尚残余约50%;最适pH为6.5,在pH为5.0~7.5范围内保温24 h仍可保留约90%剩余酶活力。该酶以Beechwood木聚糖为底物,米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_(max))值分别为5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min~(-1))。以玉米芯木聚糖为底物,研究XynB-DT水解玉米芯木聚糖的条件及产物,结果显示在温度70℃、pH 6.0条件下酶解12 h,加酶量为400 U/g,最终酶解得率为44.3%,玉米芯木聚糖的水解产物主要以木二糖和木三糖为主,表明该木聚糖酶在低聚木糖制备方面具有较大应用潜能。     

HPLC结合MALDI-TOF-MS分析木聚糖水解产物

利用HPLC结合MALDI-TOF-MS对1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后山毛榉木聚糖水解产物进行分析,检测到了难以获得标准品对照的木聚糖水解产物。结果表明,稀硫酸水解山毛榉木聚糖的主要水解产物有木糖和4-O-甲基葡萄糖醛酸-木糖(B2),以及少量4-O-甲基葡萄糖醛酸(B1)。内切重组木聚糖酶An Xyn10C水解山毛榉木聚糖产生木糖、木二糖和4-O-甲基葡萄糖醛酸-木三糖(B3),而内切重组木聚糖酶Ho Xyn11A水解山毛榉木聚糖主要产生木糖、木二糖、木三糖、4-O-甲基葡萄糖醛酸-木四糖(B4)和4-O-甲基葡萄糖醛酸-木五糖(B5)。基于PMP柱前衍生化的HPLC结合MALDI-TOF-MS方法能高效地分析复杂的木聚糖水解产物。     

纸浆漂白用木聚糖酶的选择性合成

以里氏木霉(Trichoderma reesei) Rut C-30为产酶菌,研究了碳源、培养温度、初始pH值、碳氮比对木聚糖酶和纤维素酶合成的影响.结果表明,粗木聚糖和亚硫酸盐纸浆混合作为碳源有利于木聚糖酶和纤维素酶的合成;低温有利于木聚糖酶和纤维素酶的合成,但产酶时间较长,高温对木聚糖酶的合成有一定的影响,对纤维素酶的合成能有效地抑制,且产酶时间较短;初始pH值低有利于纤维素酶的合成,初始pH值高则延长了木聚糖酶的合成时间,且强烈抑制纤维素酶的合成;低碳氮比有利于纤维素酶的合成,高碳氮比使得木聚糖酶的合成滞后,能够有效抑制纤维素酶的合成.以粗木聚糖和亚硫酸盐纸浆混合作为碳源,调控培养温度、初始pH值和碳氮比能有效地促进木聚糖酶的合成,抑制纤维素酶的合成,致使木聚糖酶活与纤维素酶活的比值提高,从而有利于选择性合成纸浆漂白用木聚糖酶,调控培养方式为:提高碳氮比(7.2)和初始pH值(6.0),在培养初期(1 d)培养温度为35～36 ℃,中后期培养温度25～26 ℃,调控6 d后,木聚糖酶酶活和纤维素酶酶活分别为186.93和0.156 IU/mL,酶活比为1 198.     

里氏木霉木聚糖酶降解粗碱木质素中木聚糖的研究

研究用里氏木霉木聚糖酶降解粗碱木质素中的木聚糖,得出了适宜的酶解条件:pH值4.8、温度 45 ℃、酶解时间 4 h.还探讨了固形物浓度和酶用量对除糖率的影响.结果表明,随着固形物浓度的增加,除糖率逐渐降低;木聚糖酶用量越大,除糖率越高.     

杨木屑木聚糖碱法提取及其制备低聚木糖的工艺研究

为充分利用杨树资源,以杨木加工废弃物杨木屑为原料,研究碱法提取木聚糖的工艺条件,并采取酶法制备低聚木糖。以质量分数为1%的稀硫酸预处理可以有效提高杨木屑木聚糖的得率,较对照组提高了2倍。对比3种碱液(NaOH、KOH和NaHCO_3)提取杨木屑木聚糖的得率,以NaOH提取的木聚糖得率最大。通过单因素和正交试验优化NaOH提取杨木屑木聚糖的条件,结果显示碱液质量分数10%,固液比1∶10(g∶mL),温度120℃下提取3 h所得的木聚糖得率可达到20.7%,且四因素对提取得率的影响显著程度依次为提取温度碱液质量分数提取时间固液比。碱法提取杨木屑木聚糖酸水解后产物由88.69%D-木糖、4.76%纤维二糖和6.62%葡萄糖组成且不含有阿拉伯糖,说明碱法提取的杨木屑木聚糖支链上主要连有木糖。以碱法提取杨木屑木聚糖为底物,优化了来源于嗜热菌Dictyoglomus thermophilum的重组木聚糖酶Xyn B-DT的酶解适宜条件:在温度70℃,pH 6.0,酶用量3.00 U/m L,反应时间12 h后,杨木屑木聚糖水解产物中以木二糖和木三糖为主,并含有少量木四糖,降解率达86.2%。研究结果为杨木屑木聚糖的高值化利用奠定了基础。     

木聚糖酶在膜反应器内的酶解特性

分别研究了粗木聚糖酶和纯化的木聚糖酶在超滤膜反应器(UMR)和常规反应器(CSBR)中的酶解特性。粗木聚糖酶或纯木聚糖酶在UMR中酶解木聚糖时,反应进行了525 m in时所得产品中低聚木糖各组分的质量分数(木二糖~木五糖)均在20%左右,木糖质量分数约为9.5%。在UMR中粗木聚糖酶降解木聚糖时的低聚木糖得率、低聚木糖占总糖的比例和低聚木糖生产能力比纯木聚糖酶在CSBR中分别高19.1%、14.8%和13.5%;而木糖的得率却低55.2%。粗木聚糖酶在UMR中酶解木聚糖时,所得低聚木糖产品中木二糖~木五糖组分含量基本相等;纯木聚糖酶在CSBR中酶解木聚糖时,所得低聚木糖产品中木二糖含量较高。同纯木聚糖酶在CSBR中酶解特性相比,粗木聚糖酶在UMR中酶解木聚糖可以制得高质量低聚木糖。     

膜反应器中木聚糖的酶水解反应

以木聚糖为底物、木聚糖酶为催化剂，在木聚糖质量浓度为30．0g/L，操作压力16kPa，进料速度400mL/min，时间12h,pH值5．0，温度为48摄氏度的条件下研究了超滤膜反应器中木聚糖的酶水解反应。结果表明，木聚糖的酶水解总糖得率为60．10％，未水解木聚糖聚合度为10左右，碱溶对聚合度没有影响，未水解木聚糖重新水解，总糖得率为7．50％。     

诱导食用真菌代谢生产木聚糖酶的研究

以木聚糖为诱导底物，对66株大型食用真菌进行液体发酵诱导培养，采用超薄层琼脂板扩散法和DNS测定法进行初筛、复筛，最终筛选出3株产木聚糖酶较高的菌株。检测单因素结合正交试验，最终确定黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236经木聚糖诱导，产木聚糖酶的最佳培养时间、pH值和底物木聚糖浓度分别为20d、7．5和1．0g／100mL；25d、7．0和1．0g／100mL；25d、5．0和0．75g／100mL，最佳条件组合时的酶活分别为：600．6IU／mL，672．5IU／mL，345IU／mL。并且，培养液pH值是影响诱导效果的主要因素。     

木霉木聚糖酶的酶学性质研究

木聚糖酶是一种应用性很强的酶。试验采用DNS法对一种木（Trichoderma）产木聚糖酶的酶学性质进行了研究，结果表明：酶的最适催化温度和pH分别为50℃和5．5，Cu^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Mn^2＋对酶活有很强的抑制作用，该酶对木聚糖和桑树叶粉分解能力很强，对其他底物分解能力微弱。     

钙离子对木聚糖酶Xyn10A热稳定性的影响

木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、纺织、能源等领域。在生产过程中木聚糖酶的热稳定性较为重要,它直接影响酶的反应温度及使用效率。添加Ca~(2+)能够显著提高来源于Thermotoga thermarum DSM 5069的木聚糖酶Xyn10A在高温(85℃)条件下的热稳定性。为解析Xyn10A酶蛋白中的Ca~(2+)结合区域及热稳定性机制,笔者采用蛋白质结构模拟和定点突变技术以确定该结合区域,并分析其对于酶热稳定性的影响机制。酶蛋白的建模和结构比对结果表明,GH10家族木聚糖酶的结构保守性远大于其序列保守性;木聚糖酶Xyn10A中局部环区(712IYRDNATKYEIPP724)涉及Ca~(2+)的结合功能,同时其热稳定性依赖于该环区与Ca~(2+)之间的亲和力。对该环区的定点突变和删除突变导致Xyn10A无法有效地结合Ca~(2+)。Ca~(2+)可与酶蛋白中的(712IYRDNATKYEIPP724)环区形成配位键,显著降低Xyn10A酶催化结构域的柔性和自由度,使Xyn10A酶能够在高温下保持优良的热稳定性,进而有效地发挥其高温催化水解木聚糖的能力。