浅谈目前猪非洲猪瘟病毒的常用诊断方法

<正>距我国首次报道非洲猪瘟病毒(ASFV)感染病例已经一周年了,一年内该病毒几乎肆虐了国土全境,随之造成了生猪存栏量锐减、猪肉价格发生猛涨的情况。近期候选疫苗出现、非洲猪瘟弱毒疫苗专利申请成功,据报道中国有关权威部门公布的首例非洲猪瘟流行毒株(SY18)为亲本构建的多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株[1]和中国流     

非洲猪瘟病毒E184L基因缺失毒株的构建及评价

为阐明更多非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)未知基因的功能，深入探究ASFV的致病机制，为研制针对ASFV流行毒株的疫苗提供候选毒株。采用同源重组的方法构建E184L基因缺失的非洲猪瘟单基因缺失毒株，在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)中评价其复制特性，并在猪体内比较ASFVΔE184L与亲本毒株ASFV CN/GS/2018对猪的致病力以及在动物体内诱导免疫应答的差异。成功获得了E184L单基因缺失突变毒株ASFVΔE184L,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定，证实该毒株E184L基因被成功缺失。复制特性研究发现，E184L基因的缺失削弱了ASFV在PAMs中的复制能力。动物体内试验显示，ASFVΔE184L接种猪在观察期内死亡1头，其余全部存活，而ASFV WT接种猪全部死亡，说明E184L的缺失导致ASFV的毒力显著下降。此外，与亲本毒株相比，ASFVΔE184L可诱导机体ASFV特异性抗体的产生及抗病毒因子干扰素β(interferon-β,IFN-β)的分泌。E184L为ASFV毒...     

越南非洲猪瘟疫苗AVAC ASF LIVE(ASFV-G-ΔMGF)研究工作分析与思考

非洲猪瘟（Afcrian swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的烈性传染病。近日,越南正式将经临床试验验证的非洲猪瘟弱毒疫苗AVAC ASF LIVE(ASFV-G-ΔMGF)在其全国推广使用。本文对越南非洲猪瘟弱毒疫苗ASFV-G-ΔMGF相关研究数据进行了总结分析,分别从ASFVG-ΔMGF株攻毒保护能力评价、传代细胞培养株临床动物实验、野猪口服接种试验、毒力返强验证等方面,结合国内相关ASFV基因缺失株试验数据进行了分析。总结分析发现：越南上市的ASFV-G-ΔMGF疫苗株,二次免疫接种后攻毒保护效果更好,但在对野猪的口服接种评价中,其口鼻接种效果存在不确定性;随着疫苗株在动物体内的不断传代,其存在毒力返强和毒株变异风险,导致接种猪只临床症状明显;ASFV-G-ΔMGF株虽然有较好的攻毒保护能力和可靠的生产优势,但仍缺乏相关研究数据,特别是在垂直传播、交叉保护、基因突变等方面。后续仍需对ASFV-G-ΔMGF株的临床应用效果进一步评价。     

新形势下中国猪场的非洲猪瘟防控

自2018年我国首次确诊非洲猪瘟疫情以来,各规模化猪场纷纷进行了非洲猪瘟防控的探索,根据非洲猪瘟病毒通过接触传播且传播速度慢的流行特点,有关猪场发明了精准清除策略,推广后得到了业内人员的广泛认可。然而随着非洲猪瘟病毒弱毒株和基因缺失株(又称为“疫苗株”)的出现,这一方法已经不如之前那样有效。本文通过对非洲猪瘟病毒的病原学、流行病学、实验室诊断以及精准清除策略的回顾,分析了当前猪场存在非洲猪瘟病毒强毒株、弱毒株和基因缺失株并存和干扰等现状,总结了非洲猪瘟诊断与防控策略。根据目前的情况,生物安全依然是预防非洲猪瘟最根本的方法,精准清除需要更加严格的采样和检测,对感染非洲猪瘟病毒弱毒株和疫苗株的猪群进行更专业的精准清除,同时需要加强对各种应激因素的控制,提高猪的抵抗力,减少非洲猪瘟病毒弱毒株潜伏感染猪的排毒量。希望本文能为我国防控和根除非洲猪瘟提供有益的参考。     

非洲猪瘟病毒基因缺失株的快速检测方法研究进展

非洲猪瘟(Afri can swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Afri can swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、高度传染性疫病。该病原对世界养猪业造成不可估量的经济影响。目前,没有针对ASFV的疫苗或其他治疗方法,预防和检测仍是对该病的主要防控措施。在我国已经出现了非洲猪瘟病毒的变异株,其中包括MGF360-505R基因缺失株。本文将就目前关于鉴别ASFV缺失株的检测方法进行论述,为后期ASFV防控提供参考。     

非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白基因重组痘苗病毒的构建及鉴定

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种猪的传染病,发病率和死亡率几乎达100%,是尚未传入我国的重要的猪烈性病。为研制安全有效的ASF储备疫苗,本研究利用本实验室改造的痘苗病毒(VV),将ASFV的结构蛋白P72和P54或CD2v和P30的基因分别插入到VV基因组中,构建了同时表达P72和P54的重组VV(rVV-P72-P54)以及同时表达CD2v和P30的重组VV(rVV-CD2v-P30)。Western blot和间接免疫荧光试验表明外源基因在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。这两株重组病毒在体外细胞培养中的增殖效率与亲本病毒无显著差异。该研究为进一步的动物免疫实验奠定了基础。     

H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究

为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响，本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1 000 bp的同源臂，分别克隆至p BS-EGFP及p BSMcherry载体中，构建同源臂质粒p BS-GFP-H240R和p BS-Mcherry-MGF505-7R，采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sg RNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA (sgRNA)，并克隆至p X330载体中，构建重组质粒p X330-sg H240R和p X330-sg MGF505-7R，经测序鉴定正确后，将线性化的同源臂质粒p BS-GFP-H240R与p X330-sg H240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，再以ASFV感染，通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化，构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R；采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R；在ASFV-ΔH240R的基础上，将线性化的同源臂质粒p BS-Mcherry-M...     

1株非洲猪瘟病毒自然变异毒株的鉴定

非洲猪瘟(ASF)于2018年传入我国后已流行了2年有余,我国非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株未曾出现较大变异。最近,针对我国ASF疫情放缓以及感染猪出现的低死亡率现象,我们在ASFV生态学研究中,从主动监测的样品中分离到1株源自湖北某地的ASFV自然变异株。经基因组测序发现,其EP402R基因(CD2v)和上游相邻的EP153R基因(8CR)出现部分缺失,共计1252 bp,导致病毒血吸附特性丧失;在多处基因编码区和基因间隔区出现独有的碱基突变、缺失或插入,与国内已经发表的10个ASFV毒株完全不同,这些变化导致病毒蛋白氨基酸组成的改变和功能丧失;在基因组3′末端出现503 bp串联重复的核酸片段插入,该片段与国外毒株基因组末端部分序列有高达96%的同源性。该变异株不含任何已知标记基因,说明我国的ASFV已经出现了自然变异株,可能和目前呈现的亚急性型流行的ASF有关。     

我国对非洲猪瘟病毒的研究进展综述

非洲猪瘟病毒进入我国已4年有余,因其无法消除且传播方式多样而对我国的养猪业造成巨大威胁。研究非洲猪瘟 病毒的毒株蛋白和基因,解析其蛋白结构和功能是研发非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒和非洲猪瘟疫苗的首要措施。本文通过对非洲猪瘟病毒蛋白基因的分析,发现非洲猪瘟病毒的一些基因可以作为诊断该病的目的基因,为非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒的研发提供了参考;且随着对非洲猪瘟病毒蛋白基因的深入解析,发现有些基因可以为非洲猪瘟疫苗的研发提供帮助。文章对非洲猪瘟病毒的功能基因、致病基因、检测基因及疫苗研发基因进行总结分析,旨在为非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒研发和疫苗研发提供参考。