猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒（CSFV）化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。     

A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的偶蹄类动物病原无交叉反应,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,具有良好的重复性。对该方法的特异性指标和敏感性指标进行了验证,同国产的A型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.98%,总符合率为93.17%。建立的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高,敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的O型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体,制备了O型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。结果表明:该方法能够定量检测猪、牛、羊血清中的O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,与其他偶蹄类动物病原无交叉反应,具有良好的重复性;对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,同国产O型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率92.62%,阴性样品符合率92.14%,总符合率92.45%;重复性试验组内与组间变异系数分别低于10%和15%。综上,该研究建立的O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

化学发光免疫试剂盒检测猪肉中呋喃西林代谢物的残留

为了快速检测猪肉中呋喃西林代谢物残留量,试验采用自主研发的以磁性微球为固定相的化学发光免疫试剂盒,并对其方法学进行评价及与高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS法)检测结果进行比较分析。结果表明:采用化学发光免疫试剂盒测定猪肉中呋喃西林代谢物的灵敏度为0.331μg/kg,精密度较好,最低检测限为0.077μg/kg,与呋喃西林原药的交叉反应率为8.9%,与其他类似物的交叉反应率均0.1%,平均回收率为92.7%~104.8%,与HPLC-MS/MS法检测样本的阴性和阳性结果一致。说明该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等特点,适用于现场快速检测猪肉中呋喃西林代谢物的残留。     

利用重组E2蛋白检测BVDV血清抗体间接Dot-ELISA方法的建立

利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA.最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1:500,血清稀释度为1:100,3%明胶-TBS作为封闭液,封闭45 min效果最佳.通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等证明,该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;与用BVDV全病毒为抗原的IDEXX ELISA试剂盒相比,特异性96.67%,灵敏度90%,符合率95%.应用建立的检测方法对河北省4个奶牛场采集的178份腹泻奶牛血清样本进行检测,结果BVDV血清抗体阳性率40.45%,与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异.     

小反刍兽疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为了建立动物血清中的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体化学发光免疫分析检测方法,采用PPRV N融合蛋白与相应单克隆抗体对化学发光抗体检测方法进行了研究。结果显示:建立的检测方法能够特异性地定量检测羊血清中的PPRV N蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的动物病原无交叉反应,组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性;对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,与法国IDVET公司的PPRV抗体检测试剂盒进行比较,阳性样品符合率为95.02%,阴性样品符合率为82.08%,总符合率为90.33%。结果表明:建立的PPRV抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。     

高敏荧光免疫层析分析法检测牛分枝杆菌抗体

为探究高敏荧光免疫层析分析法检测牛分枝杆菌（M. bovis）抗体的可行性，对该方法的特异性、灵敏性、稳定性及临床适用性进行了分析。特异性试验结果显示，该方法能够检出M. bovis抗体阳性血清参考品，而对布鲁氏菌阳性血清、O型口蹄疫阳性血清、A型口蹄疫阳性血清、样品稀释液、结核菌素皮内变态反应（TST）阴性牛血清样品等均为阴性；灵敏性试验结果显示，该方法最低可检测到3 200倍稀释的牛结核（bTB）强阳性血清参考品；稳定性试验结果显示，该方法检测bTB强阳性血清和阳性血清的变异系数分别为5.48%和5.83%；临床样本检测结果显示，该方法与IDEXX M. bovis ELISA抗体检测试剂盒的符合率为86.36%，具有较高的一致性，且差异不显著。以上结果表明，高敏荧光免疫层析分析法特异性强、灵敏度高、结果可靠，可作为TST检疫的补充抗体检测方法，用于bTB的诊断、检疫和净化。     

PRV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA）,用于猪伪狂犬病病毒（PRV）血清抗体检测。通过对IPMA反应条件的优化,组装成PRV-IPMA诊断试剂盒,并对该试剂盒检测的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验。结果表明,IPMA检测相对于SN的敏感性为96．2％,特异性为97．7％,两者的总符合率为96．9％;该试剂盒检测的重复性好,与其它病毒参考血清无交叉反应;试剂盒可在-20℃保存12个月,用该试剂盒检测PRV人工感染猪血清,于感染后2周抗体全部阳转,健康对照组猪血清抗体检测均为阴性结果。对来自黑龙江、吉林、上海、内蒙古、河北等地采集的5个猪场后备母猪150份血清样本进行检测,PRV血清抗体阳性检出率为16．7％～50％。检测结果表明这些猪场后备猪群仍需加强疫苗免疫。该试剂盒的研制为我国PRV流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。     

地方流行性牛白血病间接gp51-ELISA抗体检测试剂盒的研制

利用重组牛白血病病毒gp51蛋白作为包被抗原研制了gp51-ELISA诊断试剂盒.试剂盒主要成分包括抗原gp51包被96孔板、HRP标记的兔抗牛IgG和牛白血病阴性、阳性标准血清.对试剂盒进行了特异性、灵敏度、重复性及保存期试验.结果表明,试剂盒特异性好,灵敏度是AGlDT的4～8倍,批间和批内的变异系数分别小于10%和15%,于一20℃保存至少能保持6个月检测结果稳定.与法国Synbiotics公司同类试剂盒进行比对试验,诊断敏感性、特异性和符合率分别为75%、96.1%和94.6%.对采集于山东济南的164份奶牛血清和进口澳大利亚奶牛的398份血清进行检测,抗体阳性率分别6.10%和4.77%.