百合斑驳病毒CP与Cl基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,Cl)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上.构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CL200.重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-C1200.经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体.Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应.用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%.研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础.     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

甘蔗花叶病毒CI蛋白在玉米韧皮部细胞中的免疫定位

为探讨甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)CI基因的功能,对CI蛋白进行了免疫定位.利用RT-PCR方法,扩增甘蔗花叶病毒北京株系(SCMV Beijing isolate,SCMV-BJ)CI基因部分片段,将其连接到表达载体pET-28a上,重组质粒pETCIF1导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中.SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CI基因获得了高效表达.将融合蛋白纯化后免疫兔子获得特异性较高的抗血清,利用该抗血清,对健康玉米和受病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,在茎和叶脉韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。     

番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析

 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)是番茄斑萎病毒属的一个新种,对云南番茄、辣椒生产造成严重危害。用RT-PCR 从感病番茄中扩增得到长度为837 bp TZSV 的核壳体蛋白基因(N 基因),将其克隆到原核表达载体pET-28a( + ),获得重组原核表达载体pET-TZSV-N,在大肠杆菌BL21 中表达,SDS-PAGE 分析表明,该载体高效表达33kDa 的融合蛋白;以纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔制备TZSV 核壳体蛋白(N 蛋白)的多克隆抗体,间接酶联免疫测定(ID-ELISA)表明效价为1 / 6 000;Western blot 分析表明,该抗血清能与西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)血清组的辣椒褪绿病毒(CaCV)反应,而与番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(INSV)无血清交叉反应,说明获得的抗血清能用于WS-MoV 血清组成员的检测,TZSV 属于WSMoV 血清组成员。     

应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒

应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒(LMoV)进行RT-PCR检测.结果表明,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段.将感染LMoV组织总RNA以10倍梯度稀释成不同浓度检测,特异引物检测的灵敏度为10-4,简并引物的灵敏度为10-3.对特异引物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为90%～99%,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠.     

江西省莲花县百合病毒病分子鉴定

[目的]为了检测和鉴定采自江西省莲花县百合样品.[方法]利用已报道侵染百合的3种主要病毒黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、百合无症病毒(lily syptomless virus,LSV)的特异性引物对样品进行RT-PCR分...     

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

利用原核系统表达病毒编码的结构蛋白为抗原制备多克隆抗体是提高检测灵敏度和降低检测成本的重要途径。根据已报道的苹果茎沟病毒Apple stem grooving virus(ASGV)外壳蛋白(coatprotein,CP)基因的核苷酸序列设计合成引物,利用RT-PCR方法克隆了ASGV的cp基因(命名为ASGV cp BJ),该基因由714个核苷酸组成,与GenBank中已报道的ASGV的cp基因核苷酸相似性为86%~96%。将ASGV的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-ASGVcp。SDS-PAGE电泳分析发现,经IPTG诱导,ASGVcp在大肠杆菌中得到高效表达,获得的融合蛋白的分子量约为33kD。利用Ni珠吸附法纯化原核表达的目的蛋白,并以此蛋白为抗原制备了抗血清,ACP-ELISA检测结果显示,此抗血清效价为1∶4 096。Western blot分析结果显示,该抗血清具有高度特异性,能够用于ASGV的快速检测。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

从山东省感病的烟草上分离获得了一烟草蚀纹病毒(TEV)分离物,命名为TEV-SD1.根据已报道烟草蚀纹病毒外壳蛋白(coat protein CP)基因序列设计并合成2条引物,通过RT-PCR扩增得到长度约800bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了包含TEV CP基因的原核表达载体pETEV-CP,并导入大肠杆菌BL21中.序列分析表明:TEV-SD1的CP基因全长789bp,编码263个氨基酸;与GenBank中已报道的TEV 5个分离物CP基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为94.1%～98.6%.37℃培养条件下,BL21/pETEV-CP经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示,表达的TEV CP融合蛋白的相对分子质量约为33 kDa.以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/2048,且具有良好的特异性.     

菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒EP-1-like基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备方法

本实验提取被菜蛾盘绒茧蜂寄生后24h的小菜蛾幼虫体内总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus,CvBV)EP-1-like基因,将其分别克隆到表达载体pET30a、pET28a中,转化宿主菌BL21(DE3),获得单克隆重组质粒pET-30a-EP1L和pET-28a-EP1L。经IPTG诱导,pET-28a-EP1L成功表达了约34.8kDa的包涵体蛋白。将诱导条件优化以后,采用割胶回收的方法纯化包涵体,将纯化后的表达蛋白免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体。ELISA分析表明制备的抗体效价达1:128000,Western blot检测证明抗体具有良好的免疫反应特异性。     

齿兰环斑病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

 采用RT-PCR法从感染齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)贵州分离物的苋色藜叶片中扩增出病毒的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因保守序列。测序结果显示,该保守片段长516 bp,编码171个氨基酸残基。构建了该片段的原核表达载体pET32a-ORSV RdRp并转化BL21(DE3)菌株,在25℃以0.4 mmol·L^-1 IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为36 kDa,与预测相符合。将该重组蛋白作为抗原免疫BABL/C小鼠,制备的多克隆抗体效价达1∶102 400。间接ELISA结果表明,该多抗具有较强的特异性,能检测到ORSV感染的病叶汁液中的RdRp,而与其它感染4种同属或不同属病毒的病叶汁液不发生血清学交叉反应,本实验为进一步研究RdRp的结构和功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定基础。     

建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L~(-1) IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。     

进境荷兰百合中车前草花叶病毒的分子鉴定及序列分析

对一株进境隔离种植中疑似病毒症状的荷兰百合进行检测、鉴定。采用RT-PCR方法对疑似样品的部分基因序列进行扩增、测序,比对后,建立系统发育树进行亲缘关系分析。结果表明,采用香石竹潜隐病毒属和马铃薯X病毒属(CarlapCar1I/M4T和Potex 5/Potex 1RC)简并引物均可扩增到预期大小的片段(1 257 nts和737 nts)。序列分析显示,扩增片段与车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,Pl AMV)3'端序列(包含TGBp2、TGBp1、CP,3’-NTS)和部分依赖于RNA的RNA聚合酶基因序列一致性可达79.9%~99.5%和80.5%~99.3%。利用PlAMV的特异性引物(PlAMV-cpup/PlAMV-cpdw)进行检测,结果进一步证实该百合样品含有PlAMV。通过建立系统发育树得出,该病毒分离物与来自荷兰的PlAMV百合分离物优先聚为一簇,表明二者的亲缘关系最近。这是我国口岸首次截获车前草花叶病毒的报道。     

侵染猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备及检测应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)是β线形病毒科(Betaflexiviridae)柑橘病毒属(Citrivirus)的代表种,前期研究表明CLBV在陕西栽培猕猴桃中广泛发生。为进一步简化CLBV的检测,并探究其致病机制,通过RT-PCR扩增得到CLBV猕猴桃分离物外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将其插入原核表达载体pET-30a (+),导入E. coli BL21 (DE3)感受态细胞,成功表达出约59 kDa的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白对大白兔进行皮下多点免疫注射,获得的抗血清经纯化浓缩后,最终得到浓度为3.78 mg·mL^-1的多克隆抗体。将抗体1∶1 000稀释后可检测500 pg抗原,使用Dot-ELISA可直接检测田间猕猴桃样品。多克隆抗体的制备为CLBV的检测提供了便捷,也是后续研究CLBV致病机理的重要工具。     

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm的原核表达及抗体制备

 将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm基因克隆到原核表达载体pET-32a (+) 中,利用大肠杆菌系统表达NSm蛋白,以Ni^2＋-NTA agarose亲和柱纯化该蛋白与His组氨酸的融合蛋白,免疫家兔制备融合蛋白多克隆抗体。Western blot检测显示,该抗体与NSm重组蛋白以及普通烟病叶中的NSm蛋白具有特异性反应。采用该抗体对TSWV感染的普通烟叶片低温超薄切片进行免疫胶体金标记,透射电镜观察发现特异性金颗粒主要定位在病叶细胞的胞间连丝中,而健康烟草叶片组织中没有金颗粒特异性标记。结果表明,该抗体可用于研究NSm在细胞中的定位。     

单抗I-ELISA和TAS-ELISA检测百合无症病毒的研究

 以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接ELISA (I-ELISA)和三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)的检测方法。I-ELISA检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:20和1:6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1:2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。TAS-ELISA检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:200和1:6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1:5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agdia公司双抗体夹心ELISA (DAS-ELISA)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1:2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种ELISA方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,TAS-ELISA的灵敏度高于DAS-ELISA和I-ELISA。相同样品I-ELISA所测出的OD₄₀₅值和P/N值普遍高于DAS-ELISA,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。     

香蕉线条病毒ORFⅡ基因的原核表达及抗体制备

 ORFⅡ gene of Banana streak virus GuangDong isolate (BSV-GD) was amplified from a BSV-GD recombinant plasmid by PCR, and the gene was expressed by being cloned into prokaryote expression vector pET-28b (+). The fusion protein was about 16.5 kDa in size and was soluble with SDS-PAGE analysis. The purified protein was obtained by using the histidine labeling kit of N-terminus of protein. The antiserum was obtained by immunizing healthy rabbits with the purified protein. Western blot and ELISA analysis showed that the special antiserum of BSV possessed high titer, which was tested as 1:51 200. The study was a base for further research on BSV including ORFⅡ gene function and virus detection.     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.