百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

百脉根中Lj5NG4与结瘤因子受体LjNFR1互作调控根瘤菌侵染

以百脉根结瘤因子受体激酶LjNFR1为诱饵,通过建立百脉根根瘤共生不同时期的酵母膜双杂文库筛选获得了一个与之互作的生长素相关转运蛋白Lj5NG4。通过酵母双杂交和烟草Split-Luc等试验进一步证实了Lj5NG4与LjNFR1的蛋白互作。利用CRISPR-Cas9基因敲除及超表达技术创建相关转基因材料,研究发现Lj5NG4可能在根瘤菌侵染前期起负调控作用,但对结瘤过程没有显著影响。同时启动子表达也证实了Lj5NG4在侵染前期根毛中强烈表达,成熟根瘤内部不表达。外源施加生长素试验发现低浓度的生长素会减弱Lj5NG4突变体的早期侵染表型,这表明生长素在共生结瘤发育中通过Lj5NG4发挥功能。     

百脉根无效根瘤突变体的生物量及无效根瘤的电镜观察分析

百脉根是研究豆科植物根瘤形成和共生固氮分子机理的一种重要模式植物.为探索百脉根根瘤的形成机制,以EMS诱导野生MG-20突变并筛选的No.1006,No.486和No.2568等3种无效根瘤突变体为材料,测定其突变体植株生物量、根瘤数及固氮能,并对无效根瘤中根瘤菌感染的细胞进行电镜观察.结果表明:No.1006是根瘤原基突变体,No.486是白色无效根瘤突变体,No.2568是绿色无效根瘤突变体;这3种无效根瘤突变体植株生长至30d时,根瘤数和固氮能以及株高、地上部干质量、根干质量和根长等生物量与MG-20野生株差异无统计学意义(p0.05),但生长至40d开始均显著低于野生株(p0.05).No.486的白色无效根瘤和No.2568的绿色无效根瘤,经切片后在电镜下观察,无效根瘤细胞均存在不同程度的破坏;其中No.2568的绿色无效根瘤的细胞和由根瘤菌转化来的类菌体的破坏程度远大于No.486的白色根瘤.     

水稻根系生长素抗性突变体的筛选及表型鉴定

以经60Co-γ辐射诱变的水稻黄华占突变体库为材料,利用生长素类似物2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)处理对初生根伸长的抑制作用为筛选依据,初筛获得188个候选突变体株系。经二次筛选鉴定,最后成功筛选到4个根系生长素抗性突变体,分别被命名为Osarr1-1(水稻生长素抗性根1-1,Oryza sativa auxin resistant root 1-1)、Osarr2-1、Osarr3-1和Osarr3-2,其中Osarr3-2是从Osarr3-1中分离出来的白化苗。结果表明:在无2,4-D的情况下,Osarr3-1不定根数目明显高于野生型,其余突变体不定根数目与野生型相似;除Osarr1-1不定根伸长小于野生型外,其余突变体不定根伸长与野生型相似;Osarr3-1侧根数目大于野生型,而Osarr3-2的侧根数目小于野生型,其余突变体侧根数目与野生型相似;Osarr1-1和Osarr3-2的侧根伸长小于野生型,其余突变体的侧根伸长与野生型相似。在2,4-D存在的情况下,Osarr1-1、Osarr2-1、Osarr3-1和Osarr3-2的不定根数目和伸长均高于野生型;除Osarr3-2的侧根数目与野生型相似外,其余突变体侧根数目均高于野生型,并且所有突变体的侧根伸长均高于野生型。以上研究结果表明,筛选获得的突变体根系包括初生根、侧根和不定根对2,4-D处理具有较高的抗性。本研究为进一步揭示水稻根系生长发育调控机制提供了良好的遗传学研究材料。     

百脉根Rboh基因家族在共生固氮中的功能研究

为探索植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue,Rboh）基因家族在共生固氮中的功能和作用机制，利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法，围绕百脉根Rboh基因家族中在根瘤中特异性表达的基因LjRbohA（Lj5g3v1497840）以及在根瘤中高表达的基因LjRbohB（Lj6g3v1549190）和LjRbohC（Lj5g3v1497820），分别对其蛋白的亚细胞定位、基因的表达模式、基因的启动子活性及蛋白的功能进行了研究。结果显示：LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC蛋白都定位在植物的细胞膜上；LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因在接种根瘤菌后表达上调；LjRobhA和LjRobhB基因在根瘤、维管束和侧根原基表达；利用CRISPR Cas9技术对LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC 3个基因分别进行敲除导致结瘤数目减少。这些研究结果表明，LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC这 3个基因可能都参与调控百脉根与根瘤菌的共生结瘤过程。     

百脉根根瘤菌MAFF303099 Tn5转座子插入突变体库的构建及筛选

以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10~(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。     

拟南芥非特异性磷脂酶C2的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性研究

在拟南芥中有6个非特异性磷脂酶C(NPC1~NPC6)。GUS染色显示NPC2在根中主要是在根尖分生区和伸长区表达,在成熟区主要是在维管组织中表达;在叶中,NPC2主要在发育的叶片中表达,随着叶片成熟进程,NPC2基因的表达量逐渐降低。npc2-1突变体的PC-PLC活性比野生型降低47.7%,互补的植物能不同程度地恢复突变体的PC-PLC酶活性。这说明NPC2具有PC-PLC酶活性。NPC2基因在侧根形成位点的表达虽然与IAA诱导的侧根形成紧密相关,但外源IAA处理野生型和突变体之间的侧根密度、主根长度和侧根总长无明显区别。     

异三聚体G蛋白在IAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用

以拟南芥的野生型（ws）和异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体（gpa1-1,gpa1-2）和超表达突变体（wGα,cGα）为材料,通过施加不同浓度（0~0.8 mg/L）的IAA处理,对拟南芥根生长发育的一些形态指标进行了观测比较。结果表明：①随着培养基中IAA浓度的不断升高,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度IAA处理下,无明显差异;②IAA在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在相同浓度IAA诱导的侧根生长中,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少。初步证明,G蛋白不参与主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

天冬氨酸转氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

为寻找根瘤菌中与共生固氮相关的调控基因,采用同源重组法,分别敲除中慢生根瘤菌MAFF303099在与豆科植物百脉根共生固氮过程上调表达的10个基因,研究它们对共生固氮的影响。结果显示:Δmlr5883敲除突变体相比于野生型MAFF303099,其固氮酶活性下降40%,侵染细胞形态未发生显著改变,对Δmlr5883回补可恢复固氮酶活性;预测mlr5883编码天冬氨酸氨基转移酶,体外检测该酶的天冬氨酸转氨酶活性为16.67 U/mg。该基因的突变会影响固氮效率,推测其可能参与对植物供给碳源的代谢过程。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。     

欧美山杨杂种插穗不定根2个发育时期基因表达谱分析

以欧美杂种山杨嫩枝插穗为实验材料,进行扦插不定根生成过程中插穗形态和解剖学观察,通过Solexa高通量测序对扦插后6和12 d插穗不定根生成部位进行转录水平上的检测分析。插穗解剖观察发现扦插后6 d为根原基的诱导期,12 d为不定根的伸长生长期,对插穗不定根2个时期高通量测序获得差异表达基因2 328个。对筛选出的显著差异表达基因进行功能注释、分类和KEGG及pathway分析,确定2个山杨样本中差异表达基因参与的生化代谢和信号转导途径。      

树木插条生根形态特征和解剖特性的研究

本文对树木插条生根的形态特征和解剖特性进行了研究。提出了划分插条生根类型的标准,并对44科91属143种树木插条生根进行了分类。通过对白榆、刺槐、毛白杨、I—69/55杨、银杏、木槿等树种插条生根解剖特性的研究,认为愈伤根是从幼嫩愈伤组织中分化发育形成的,愈伤根的发育过程是:愈伤组织→根原基发端细胞→根原基发端→根原基→愈伤根。愈伤组织与生根有直接关系。     

紫云英2个转脂蛋白基因在共生及重金属镉胁迫条件下的表达特征

采用实时荧光定量PCR技术,研究了紫云英共生表达的非特异性转脂蛋白编码基冈AsE246和AsJB259在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特征,并初步考察了其在重金属镉胁迫条件下表达水平的变化.结果表明:2个目标基因仪在紫云英根瘤中特异表达,并且均在接种华癸中慢生根瘤菌7653R后22 d左右表达量达到最高.在低浓度...     

CRISPR/Cas9在豆科植物毛根转化中的应用及共生基因的编辑

将CRISPR/Cas9系统与毛根转化相结合,在豆科植物百脉根和大豆中对结瘤因子受体激酶基因NFR1进行多靶点敲除,旨在快速、便捷获得目的基因突变体。结果表明:在百脉根和大豆中均获得了目的基因敲除的突变体;其中,百脉根LjNFR1基因中靶位点1处的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0;大豆GmNFR1靶位点1处的敲除效率为33.3%,靶位点2处的敲除效率为41.7%。进一步测序分析发现,CRISPR/Cas9系统可同时敲除大豆基因组上编码NFR1的2个同源基因(GmNFR1和GmNFR1b),为研究植物体内基因的功能冗余提供了技术支持。同时,CRISPR/Cas9系统在毛根转化中的运用进一步地缩短了获得突变体的周期。     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

中棉所47及其亲本苗期根和叶基因差异表达研究

 以国审高优势杂交棉中棉所47及其亲本苗期的根尖和顶尖叶为研究材料，采用差异显示技术（DDRT-PCR）分析了苗期杂种与亲本的根、叶基因表达差异，并结合中棉所47及其亲本的产量性状，分析了苗期基因表达差异与产量性状优势之间的关系。结果表明：（1）苗期根和叶基因表达有差异的带分别占总统计带数的38.8%和65.2%，叶基因表达有差异的带比根丰富得多，说明一些对杂种优势起作用的基因可能在叶中开始表达；（2）杂种和亲本间存在显著的基因表达差异，这些差异表达分为4种类型：I．双亲共沉默型；II．单亲表达沉默型；III．杂种特异表达型；IV．单亲表达一致型。在根中，这4种比例分别为6.5%、10.6%、6.5%和15.2%；在叶中，这4种类型比例分别为 4.4%、17.9%、15.1%和27.8%，两器官基因差异表达的类型比例趋势基本一致，单亲表达一致型所占比例最高，说明苗期这种表达类型可能对杂种优势的形成起主要作用；（3）进一步分析中棉所47的产量构成因素，单株铃数增加是杂种高产主要原因，进一步表明，苗期单亲基因表达一致型可能对杂交种后期单株成铃数的增加有较大的贡献。上述结果表明，苗期基因表达差异与杂种优势的形成存在着密切关系。     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

外源CaCl2缓解NaCl胁迫下酸枣幼苗叶和根转录组测序分析

【目的】研究CaCl₂缓解酸枣盐胁迫的分子机制。通过转录组测序分析,为研究CaCl₂缓解酸枣盐害分子机制提供参考。【方法】研究以水培酸枣幼苗为材料,150 mmol/L NaCl和150 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl₂分别处理6 h,利用高通量测序技术对酸枣幼苗叶片和根系进行了转录组测序与组装,对获得的所有Unigene在GO、KEGG数据库中进行功能注释。【结果】 与对照组相比,在外源CaCl₂处理下酸枣幼苗叶片上调和下调的差异表达基因分别7 365个和1 247个,根系分别有762个和4 861个。【结论】GO数据库比对,酸枣幼苗叶片富集了43个GO条件,根系富集了42个GO条件,叶片和根系均是催化活性被富集到差异基因最多;KEGG数据库比对,差异基因主要涉及植物病原互作、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导、苯丙醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等。     

水稻裂颖突变体srg花器官突变的形态发生及遗传分析

在水稻Lemont×Dular的重组自交系群体(RILs,F10)中发现了裂颖突变体(split rice glume,srg).利用扫描电子显微镜观察野生型水稻和裂颖水稻的颖花原基分化情况,结果发现,突变体水稻的幼穗在形成内、外稃原基后,有些颖花在形成浆片后并不是直接发育形成雄蕊原基,而是在外稃或内稃原基内侧又分化出浆片原基;有些颖花原基从中间缢裂,缢裂的颖花原基又分别形成类稃片的结构,颖花发育后期,6枚雄蕊发育畸形,并且观察到不同数目的雄蕊.同时以突变体作母本,Dular、Lemont为父本配制杂交组合进行遗传分析,F2表型和χ2测验结果表明,该突变性状受单基因隐性控制.