基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

筛选与黄瓜花叶病毒CP互作的寄主因子

黄瓜花叶病毒外壳蛋白是病毒最重要的致病因子。在病毒的侵染过程中扮演多种角色,尤其是对病毒侵染症状起了决定作用。本研究首先构建了烟草叶片c DNA文库,并将CP构建到酵母双杂交诱饵质粒上,利用酵母双杂交的方法筛选出与CP互作的寄主因子。结果显示,获得了高质量的烟草c DNA文库,并利用该文库筛选到与CP互作的多个潜在因子。     

利用酵母双杂交筛选与马铃薯Y病毒CKVNP互作的寄主蛋白

 马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY^N)侵染烟草后烟草表现叶脉坏死症状,但其致病的分子机制,特别是与病毒互作的宿主蛋白研究鲜有报道。PVY^N(JQ971975)的CKVNP编码区(CI-6K2-VPg-NIa-Pro区域,核苷酸5 540-6 491)与烟草表现叶脉坏死症状相关,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染致烟草表现叶脉坏死症状的分子机制。本文将PVY^N的CKVNP编码区定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding Domain,BD)载体上,构建与激活功能域(Activation Domain,AD)融合表达的烟草cDNA文库,用CKVNP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明:诱饵质粒插入的CKVNP编码区可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株无自主激活能力;烟草cDNA文库容量为7.0×10⁶ CFU/mL,且插入片段平均大小在1.0 kb以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有94个候选基因与CKVNP在酵母中互作。挑选22个酵母质粒进行测序得到这些基因的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些基因共编码14种蛋白。     

大麦条纹花叶病毒中国株编码βC蛋白可以自身相互作用

以分别含有BSMV-CH基因组3个组分ds-cDNA全长的pMD-α、pMD-β和pMD-γ质粒为模板,PCR扩增BSMV-CH编码各蛋白基因,克隆至酵母双杂交载体,检测各蛋白是否存在自身激活特性,用酵母双杂交分析BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用情况,测定β-半乳糖苷酶活性确认蛋白在酵母体内的作用,Western-blot分析蛋白的体外相互作用。结果表明成功克隆到BSMV-CH编码蛋白基因,并正确克隆至酵母双杂交载体,酵母双杂交检测未发现BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用,但确定BSMV-CH编码的βC蛋白可以自身相互作用,体外可以单体或二聚体形式存在。     

用酵母双杂交筛选与南瓜蚜传黄化病毒MP互作的寄主因子

植物病毒编码的移动蛋白(movement protein,MP)介导病毒在寄主体内的移动,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染过程中的分子机制。将南瓜蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus(CABYV)MP基因定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding domain,BD)载体上,并构建与激活功能域(activation domain,AD)融合表达的西瓜茎叶cDNA文库,然后用MP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵质粒插入的MP基因可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株AH109和Y187没有自主激活能力;文库滴度为2.94×106CFU/mL,且大多数插入片段在700bp以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有48个候选阳性克隆与MP在酵母中互作。测序得到这些克隆的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些克隆共编码12种蛋白。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。     

致病疫霉诱导的马铃薯酵母双杂交文库构建及无毒蛋白PiAVR3b寄主靶标筛选

致病疫霉是引起番茄、马铃薯晚疫病的植物病原卵菌,其分泌的效应蛋白在抑制寄主免疫方面发挥重要功能。鉴定效应蛋白的寄主靶标对研究植物与病原菌互作具有重要意义。本研究构建了高效马铃薯酵母双杂交cDNA文库,并通过筛选致病疫霉无毒蛋白PiAVR3b的互作蛋白来评价构建文库质量。分别提取接种致病疫霉后24 h和48 h的马铃薯栽培种‘合作88’叶片RNA,等量混合后构建cDNA文库。次级文库容量为1.6×10~7 cfu/mL,重组率为100%,插入片段平均在1 000 bp以上。以PiAVR3b为诱饵,通过酵母双杂交筛选初步获得10个候选靶标蛋白。经点对点验证,进一步确定了4个与PiAVR3b互作的靶标蛋白,分别是马铃薯MYB-like蛋白、线粒体外膜孔蛋白、碳分解代谢抑制蛋白、肽基脯氨酰异构酶。本研究构建的酵母双杂交文库为致病疫霉效应蛋白靶标筛选及植物与病原菌互作研究奠定了基础。     

香蕉束顶病毒海口分离物基因组的克隆及序列分析

 以海口香蕉束顶病株的幼嫩假茎和叶片总DNA为模板,通过反向PCR法克隆了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物(命名为BBTV-HaiKou)的6个DNA组分的全长序列。结果表明,DNA1~6序列全长分别为1106、1040、1058、1040、1013和1082nt。各组分非编码区各包含一个茎环共同区和一个主要共同区,同源性分别为91.55%和88.45%。各组分编码区均编码一个开放可读框(ORF),其中DNA1 ORF内部还有一个小的ORF。序列分析表明,BBTV-HaiKou分离物与其它分离物间的DNA1最为保守,DNA2变异最大。DNA1组分核苷酸序列与亚洲组、南太平洋组各分离物及ABTV (Abacá bunchy top virus)分离物同源性分别为93.1%~99.1%,89.6%~90.7%和76.2%~77.4%,相应的编码蛋白氨基酸序列同源性在BBTV和ABTV中分别为93.4%~100%和85.7%。根据Karan等的分类方法,确定BBTV-HaiKou分离物属于亚洲组成员。     

小麦FtsH2蛋白与WYMV CP互作研究

 小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,主要危害冬小麦。实验室前期以WYMV外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库,发现FtsH2蛋白部分片段与WYMV CP互作。FtsH2蛋白是AAA蛋白酶家族成员,参与植物叶绿体光损伤修复和类囊体发育进程。本研究利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步对FtsH2蛋白全长与WYMV CP进行互作验证,并鉴定互作结构域;利用荧光蛋白标记技术研究FtsH2蛋白与CP的亚细胞定位。实验结果表明FtsH2蛋白全长与CP互作;两者互作的关键结构域包含FtsH2蛋白低复杂区、跨膜区及AAA结构域和WYMV CP的中段区域(61-293 aa)。FtsH2蛋白单独表达时定位在细胞质、细胞核和叶绿体;CP单独表达时定位在细胞质;两者共同表达时亚细胞定位均没有发生明显变化,且主要共定位于细胞质中。WYMV CP与小麦FtsH2蛋白的互作可能会干扰植物绿叶体的发育和功能。本研究对了解WYMV的症状形成机制具有一定意义。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅱ基因的克隆、原核表达与抗血清制备

 用CTAB法从感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因,克隆并测序。结果表明,SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因全长486 nts,编码161个氨基酸。将其与SVBV美国分离物以及花椰菜花叶病毒属其他成员的ORF Ⅱ基因相比较,结果表明,SVBV中国分离物 ORF Ⅱ基因与SVBV美国分离物的核苷酸序列相似性最高,达91.2%。将SVBV ORF Ⅱ基因插入原核表达载体pET32a（+）,重组质粒pET-ORF Ⅱ转化大肠杆菌BL21（DE3）。经IPTG诱导及Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为38 kDa的融合蛋白。以此纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,可以制备出高效价的抗血清。Western blot分析表明,制备的抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应。利用抗血清进行ELISA测定,能够检测出感病草莓植株病汁液中SVBV ORF Ⅱ基因表达的蛋白。     

利用酵母双杂交研究葡萄卷叶伴随病毒2号 p24与寄主互作的初步结果

葡萄卷叶病(grapevine leafroll disease,GLRD)是一种世界性病毒病害,严重影响葡萄生产和葡萄酒产业.至今已报道11种具不同血清学关系的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-asso-ciated virus,GLRaV)均可引起葡萄卷叶症状,其中GLRaV-2为长线形病毒属(Closterovirus)成员[1].     

利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

正小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf,WBD)是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节[1]。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein, IMP)与介体异沙叶蝉肌动蛋白互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。     

利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

In order to investigate interactive proteins in leafhopper (Psammotettix alienus L.) with WBD phytoplasma, the protein interaction analysis was performed by using WBD phytoplasma IMP (immunodominant membrane protein) as bait protein to screen a cDNA library of leafhopper using a split-ubiquitin yeast membrane system. Through the screening test, 30 clones were obtained from the cDNA library and 8 proteins were identified by searching against NCBI database, such as tubulin, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, Cdc42 protein, ribosomal proteins and ATP-F0 subunit protein, etc. The interactions between IMP and 8 putative proteins were further confirmed by co-transformation and β- Galactosidase assays. This study could be useful for understanding the molecular interaction mechanism between WBD phytoplasma and insect vector and the specificity of transmission.     

葡萄浆果内坏死病毒侵染的‘贝达'葡萄cDNA文库构建及其利用

 葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus, GINV)侵染葡萄可引起葡萄叶片表现明显的褪绿斑驳症状,其致病的分子机制,特别是病毒与寄主互作蛋白的研究尚未见报道。本研究构建了GINV侵染的‘贝达'葡萄叶片的cDNA文库,并以GINV 外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵筛选文库中与其互作的寄主因子。本研究构建的cDNA文库库容量达1.6×10⁷,插入片段平均大小在1.0 kb以上,质量符合cDNA文库筛库要求。筛选到了55个候选寄主蛋白与GINV CP在酵母中互作。经测序分析及回转验证,结果确定了17个寄主互作蛋白,其涉及叶绿体相关类蛋白、泛素化相关蛋白、防御相关蛋白等。本研究可为深入研究GINV致病性及其与寄主互作机制提供依据。     

建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L~(-1) IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.