4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测

 葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。     

葡萄卷叶相关病毒2号在美国密苏里州杂交葡萄“Vidal Blanc”品种上的首次报道

葡萄卷叶病是在世界范围内普遍发生的病毒病害之一。目前已知至少有10种葡萄卷叶相关病毒(GLRaV 1～7号,9号,10号,11号)与这种病害有关。葡萄卷叶相关病毒2号(GLRaV-2)有许多不同的分离物,它们不仅能引起卷叶症状,还会引起嫁接不亲和、葡萄幼树衰退、砧木茎部枯死等。     

基于DPO引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶伴随病毒3号

正葡萄卷叶病是葡萄上一种重要的病毒病,在国内分布较为普遍,引起该病的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)是由多种病毒单独或复合侵染造成。已报道的GLRaVs至少有5种,其中GLRaV-3是葡萄卷叶病毒属Ampleovirus典型成员(Ling et al.,2004)。目前,检测GLRaV-3的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法、     

基于DPO引物的SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶伴随病毒3号

葡萄卷叶病是葡萄上一种重要的病毒病,在国内分布较为普遍,引起该病的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)是由多种病毒单独或复合侵染造成.已报道的GLRaVs至少有5种,其中GLRaV-3是葡萄卷叶病毒属Ampleovirus典型成员(Ling et a1.,2004).目前,检测GL-RaV-3的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法、分子生物学检测法等,而这几种技术均存在不足.SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR技术关键要避免引物之间、引物与其它模板之间的非特异性互作干扰.由于DPO引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感等特点(Chun et al.,2007),因此,本研究结合SYBR Green和DPO引物的各自优点,建立一种特异性强、灵敏度高的GL-RaV-3检测方法,以期为葡萄卷叶病毒的快速检测及预防提供技术支持.     

葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测

研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。     

葡萄卷叶伴随病毒2号和3号辽宁分离物部分基因组的序列分析

 将采自辽宁兴城地区在生长期间具典型卷叶病症状的金星无核(Venus Seedless)葡萄品种休眠枝条,用RT-PCR检测4种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated viruses,GLRaVs),扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)和葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)两种病毒的主要外壳蛋白(major coat protein,CP)基因的完整序列(GenBank登录号分别为FJ786017和FJ786016)。这表明该葡萄植株受到了GLRaV-2和GLRaV-3辽宁分离物(GLRaV-2-LN和GLRaV-3-LN)的复合侵染。根据检测结果,克隆了GLRaV-2-LN基因组3'端CPm (minor capsid protein)、p19(19-kDa protein)和p24(24-kDa protein)基因(GenBank登录号分别为FJ786018、FJ786019和FJ786018)。序列分析表明,GLRaV-3-LN的CP基因全长942 nt,与已报道的国内外其它分离物CP基因全序列相比,核苷酸序列同源性为89.8%~91.8%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.9%~97.4%。GLRaV-2-LN的CP、CPm、p19和p24基因全长分别为597 nt、672 nt、486 nt和618 nt。与国外报道的几个分离物的相应蛋白基因全序列相比,核苷酸序列同源性分别为88.3%~100.0%、78.7%~99.9%、75.1%~99.4%和87.5%~99.5%;由此推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100.0%、89.2%~100.0%、73.9%~99.4%和89.3%~99.0%。     

山东葡萄产区主要病毒病发生危害调查

采用DAS- ELISA检测方法 ,对山东省葡萄主产区的葡萄病毒病害进行了调查 ,明确危害当地葡萄主要是葡萄扇叶病毒 (grapevine fanleaf virus ,GFLV)和葡萄卷叶病毒 (grapevine leafroll associated virus,GLRaV)。病毒感染率为 59.1% ,其中鲜食品种病毒感染率为57% ,酿酒品种的感染率为 62.5%。苗木与成龄树感染GFLV的比率分别为 78.4%和56% ,感染GLRaV的比率分别为55.3%和70%。病毒感染率较高的品种有霞多丽、梅露汁和佳丽酿。病毒病的发生与品种、栽培年限、繁殖方式和苗木来源有关 ,其中带毒苗木是葡萄病毒病传播的关键因素     

国外检疫

土耳其首次报道葡萄卷叶伴随病毒-4土耳其是世界上重要的葡萄产区,种植面积约为500 000hm2,年产量约为400万t。土耳其的葡萄产区主要集中在Aegean、Southeast Anatolia和Anatolia的中部地区,并且Aegean地区的葡萄种植面积占土耳其葡萄总种植面积的29%。以前的研究表明,引起葡萄卷叶病害的葡萄卷叶伴随病     

葡萄卷叶病毒的ELISA检测

 葡萄卷叶病毒[GLRV]是世界上分布最广和最为严重的主要葡萄病毒之一。     

日本发生的葡萄病毒类病毒病

目前,被认为是病毒或病毒性的葡萄病害有３０多种,从葡萄上检测出病毒约３０种（Ｂｏｖｅｙ等,１９８０）,并已弄明,其中的２０种病毒的传播媒介为昆虫、线虫、土壤菌（表１）。其中,世界性广泛发生、危害严重的有葡萄扇叶病、葡萄卷叶病,尤其在欧美,以扇叶病为代...     

可可毛色二孢菌侵染后的烟草酵母双杂交cDNA文库构建

正葡萄是世界上最重要的经济果树之一,据联合国粮食及农业组织统计,截止到2013年,中国葡萄栽培面积已达715.5万hm2,葡萄总产量超2 300万kg。长期以来,葡萄病害是影响葡萄产业健康发展的重要因素。近年来研究发现由葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病     

利用酵母双杂交筛选与马铃薯Y病毒CKVNP互作的寄主蛋白

 马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY^N)侵染烟草后烟草表现叶脉坏死症状,但其致病的分子机制,特别是与病毒互作的宿主蛋白研究鲜有报道。PVY^N(JQ971975)的CKVNP编码区(CI-6K2-VPg-NIa-Pro区域,核苷酸5 540-6 491)与烟草表现叶脉坏死症状相关,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染致烟草表现叶脉坏死症状的分子机制。本文将PVY^N的CKVNP编码区定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding Domain,BD)载体上,构建与激活功能域(Activation Domain,AD)融合表达的烟草cDNA文库,用CKVNP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明:诱饵质粒插入的CKVNP编码区可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株无自主激活能力;烟草cDNA文库容量为7.0×10⁶ CFU/mL,且插入片段平均大小在1.0 kb以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有94个候选基因与CKVNP在酵母中互作。挑选22个酵母质粒进行测序得到这些基因的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些基因共编码14种蛋白。     

用酵母双杂交筛选与南瓜蚜传黄化病毒MP互作的寄主因子

植物病毒编码的移动蛋白(movement protein,MP)介导病毒在寄主体内的移动,研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染过程中的分子机制。将南瓜蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus(CABYV)MP基因定向克隆到含有DNA结合功能域(DNA-binding domain,BD)载体上,并构建与激活功能域(activation domain,AD)融合表达的西瓜茎叶cDNA文库,然后用MP为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵质粒插入的MP基因可读框和氨基酸序列均正确,对酵母菌株AH109和Y187没有自主激活能力;文库滴度为2.94×106CFU/mL,且大多数插入片段在700bp以上,质量符合筛选要求;经过筛选和共转化回转验证,有48个候选阳性克隆与MP在酵母中互作。测序得到这些克隆的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些克隆共编码12种蛋白。     

葡萄浆果内坏死病毒侵染的‘贝达'葡萄cDNA文库构建及其利用

 葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus, GINV)侵染葡萄可引起葡萄叶片表现明显的褪绿斑驳症状,其致病的分子机制,特别是病毒与寄主互作蛋白的研究尚未见报道。本研究构建了GINV侵染的‘贝达'葡萄叶片的cDNA文库,并以GINV 外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵筛选文库中与其互作的寄主因子。本研究构建的cDNA文库库容量达1.6×10⁷,插入片段平均大小在1.0 kb以上,质量符合cDNA文库筛库要求。筛选到了55个候选寄主蛋白与GINV CP在酵母中互作。经测序分析及回转验证,结果确定了17个寄主互作蛋白,其涉及叶绿体相关类蛋白、泛素化相关蛋白、防御相关蛋白等。本研究可为深入研究GINV致病性及其与寄主互作机制提供依据。     

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

沼泽红假单胞菌Atp2蛋白的原核表达及稻瘟病菌的互作蛋白初步筛选

光合细菌沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris PSB06是对稻瘟病具有良好防效的生防菌株。为进一步挖掘其生防代谢产物，前期通过蛋白层析分离技术，从PSB06培养液中鉴定到一个ATP合成亚基Atp2蛋白，ATP2基因编码序列为1431 bp。构建了pET32a（+）-ATP2重组表达载体，原核表达纯化后获得的Atp2蛋白产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。试验证明Atp2蛋白显著抑制稻瘟病菌的附着胞形成和在水稻寄主上的致病力。为阐明Atp2蛋白抑菌机理，通过酵母双杂交技术，以Atp2为诱饵筛选稻瘟病菌cDNA文库，获得了7个与Atp2有相互作用的蛋白质，分别是E3泛素连接酶复合物（MGG_04978），两个核糖体蛋白（MGG_16204、MGG_04977）和4个假定蛋白（MGG_09168、MGG_01034、MGG_03543、MGG_00718），研究结果为揭示Atp2蛋白抑制稻瘟病菌的作用机制提供理论基础。     

利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

正小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf,WBD)是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节[1]。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein, IMP)与介体异沙叶蝉肌动蛋白互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。     

利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

In order to investigate interactive proteins in leafhopper (Psammotettix alienus L.) with WBD phytoplasma, the protein interaction analysis was performed by using WBD phytoplasma IMP (immunodominant membrane protein) as bait protein to screen a cDNA library of leafhopper using a split-ubiquitin yeast membrane system. Through the screening test, 30 clones were obtained from the cDNA library and 8 proteins were identified by searching against NCBI database, such as tubulin, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, Cdc42 protein, ribosomal proteins and ATP-F0 subunit protein, etc. The interactions between IMP and 8 putative proteins were further confirmed by co-transformation and β- Galactosidase assays. This study could be useful for understanding the molecular interaction mechanism between WBD phytoplasma and insect vector and the specificity of transmission.     

酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。