小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应

 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦上的重要病害。研究小麦条锈菌在致病过程中分泌的毒性效应蛋白分子的功能,对揭示小麦条锈菌致病机理,进而研发病害防治新方法具有重要意义。前期在小麦条锈菌吸器转录组中筛选到一个高丰度表达的分泌蛋白基因HASP2。HASP2基因全长240 bp,其编码的蛋白质N端包含22_aa的信号肽,无跨膜区,无结构域。qRT-PCR显示HASP2在条锈菌CYR32侵染早期上调表达;农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明HASP2能够抑制由小鼠凋亡蛋白BAX诱导的烟草细胞坏死;利用细菌三型分泌系统(T3SS)将 HASP2在小麦中过表达,发现其可以抑制寄主PTI(PAMP-triggered immunity)相关胼胝质积累;同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后,发现HASP2可以抑制寄主ETI(Effector-triggered immunity)相关活性氧积累和减少细胞坏死面积,但HASP2过表达对条锈菌的生长发育没有显著影响。     

小檗公式在小麦条锈菌侵染过程中的表达特征

 小檗是小麦条锈菌的转主寄主,自然条件下在小檗上进行有性生殖不仅是条锈菌毒性变异的重要途径,也为病害的流行提供了初侵染源。目前条锈菌与小麦互作已经有较为细致深入的研究,而条锈菌与小檗分子互作的研究未见报道。NPR1是植物调控防卫反应的一个关键基因,本研究克隆得到小檗NPR1基因(BhNPR1),并对BhNPR1及其下游病程相关基因的表达模式进行了分析。与小麦NPR1基因受条锈菌夏孢子侵染诱导不同,BhNPR1的表达水平在条锈菌担孢子侵染小檗过程中保持稳定。另外,条锈菌侵染小檗过程中NPR1下游的病程相关基因BhPR5和BvPDF1.2a的表达量变化也不明显,而BhPR1和BhPR2则显著上调表达。这些结果表明BhNPR1及多个病程相关基因不参与对条锈菌的防卫反应,这可能是导致小檗先天免疫缺陷而成为多种锈菌共同的转主寄主。     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

外源水杨酸诱导大麦对条纹病的抗性研究

 条纹病是影响大麦生产的主要病害之一,降低大麦条纹病的发生对大麦稳产具有重要意义。水杨酸作为植物内源激素,可以通过激活植物过敏反应和调节植物病程相关蛋白基因表达从而诱导植物产生系统性抗性。本研究以感病大麦品种Alexis为材料,分别采用0、5、10、15和20 mmol·L^-1浓度的水杨酸浸种后接种大麦条纹病菌(Pyrenophora graminea),三叶期调查Alexis的发病率、病情指数及生长状况;以10 mmol·L^-1浓度的水杨酸处理Alexis种子后人工接种P. graminea,测定不同侵染时间Alexis胚芽的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,并检测侵染8 d后Alexis抗病相关基因的相对表达量,旨在明确不同水杨酸浓度对Alexis抗病性的影响及水杨酸诱导Alexis产生抗性的机制。结果表明:0、5、10、15和20 mmol·L^-1的水杨酸处理下,Alexis的发病率呈先下降后上升的趋势,病情指数与发病率的变化趋势一致;10 mmol·L^-1的水杨酸处理下Alexis的发病率及病情指数较其他浓度处理显著降低;10 mmol·L^-1的水杨酸处理下,Alexis的株高、根长、鲜质量及干质量变化显著,分别是0 mmol·L^-1水杨酸处理的1.27、1.33、1.27和1.47倍;Alexis萌发2~8 d内,接菌后Alexis胚芽的POD、CAT及SOD活性均高于不接菌处理,PAL活性于第2、4和8 d 时高于不接菌处理;水杨酸接菌处理下Alexis胚芽的POD、CAT、SOD及PAL活性均高于接菌处理;第8 d 水杨酸接菌处理下Alexis抗病相关基因HORVU2Hr1G116090(TGA)和HORVU2Hr1G033620(PR)的相对表达量较接菌处理显著升高,可能参与了Alexis对条纹病菌抗病调控。研究结果可为应用水杨酸防治大麦条纹病提供理论依据。     

内吸杀菌剂烯唑醇对小麦条锈菌和白粉菌发育影响的研究

 小麦幼苗分别用小麦条锈菌和白粉菌接种3天后,用内吸杀菌剂烯唑醇喷雾施药。电镜观察烯唑醇对条锈菌和白粉菌在寄主上发育的影响,结果表明,烯唑醇引起两种病菌和寄主细胞发生一系列变化。小麦条锈菌和白粉菌菌丝细胞壁的内层普遍不规则地加厚,菌丝细胞的隔膜发育受阻而成为畸形;两病菌的吸器外间质变宽,并沉积有电子致密度较高的物质。小麦条锈菌的部分吸器母细胞产生的畸形入侵栓,不能穿透寄主细胞壁,部分吸器不能正常发育,吸器体呈分枝状,不能完全扩张、膨大。此外,被侵小麦细胞所分泌的物质可将条锈菌吸器完全包围起来。小麦条锈菌和白粉菌以上的细胞学变化可能导致了它们进一步发育受阻。     

三唑酮拌种对小麦条锈病菌叶部侵染过程的影响

 供试小麦种子用干拌法施药,在一叶期接种小麦条锈菌(Puccinia striiformis West)毒性小种,用整叶透明染色方法研究三唑酮拌种对条锈菌叶部侵染过程的影响.结果表明,由初生吸器形成开始,三唑酮对吸器产生和菌落扩展表现出多方面的影响.拌种植株叶片中条锈菌侵染菌丝的生长和分枝严重受阻,吸器母细胞和吸器形成显著减少,菌落亦不再进一步分化,多数侵染点还出现寄主细胞坏死。这些组织病理学变化与抗病品种的过敏性坏死反应很相似.     

PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

 小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。     

条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

 条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。     

陕西省115个小麦品种(系)抗条锈病基因的分子检测

 为掌握陕西省主栽与后备小麦品种对我国条锈菌的抗性水平,明确其抗锈基因分布,本研究选用条锈菌流行小种CYR32和新毒性小种V26对115份陕西省主栽和后备小麦品种(系)进行苗期抗病性鉴定,并分别利用抗条锈病基因Yr5、Yr9(1B/1R)、Yr10、Yr18和Yr26的紧密连锁分子标记对这115份材料进行了分子检测。结果表明,供试小麦品种(系)中,抗CYR32的有61份,占53.04%;抗V26的有84份,占73.04%;对2个小种均抗病的有50份,占43.48%。分子检测发现115份材料均不含有Yr10;可能携带Yr9基因的有41份,占35.65%;可能含有Yr5、Yr18和Yr26的材料分别为3份、3份和2份,占2.61%、2.61%和1.74%。因此,当前陕西省主栽与后备小麦品种(系)对CYR32和V26的抗性整体水平还有待进一步提高,Yr9分布频率较高,而Yr5、Yr10、Yr18和Yr26分布频率较低,建议在以后小麦育种中减少Yr9的使用,加强利用Yr5和Yr18与其他有效基因聚合培育持久抗条锈病品种。     

烟草赤星病菌嘧菌酯敏感与抗性菌株的代谢表型差异分析

 为了解烟草赤星病菌(Alternaria alternata)嘧菌酯抗性菌株与敏感菌株在代谢表型上的差异,采用Biolog代谢表型技术比较了抗性菌株(6-5和6-11)和敏感菌株(J6)的950种代谢表型。结果表明,抗性菌株和敏感菌株在代谢表型上基本一致,2个抗性菌株均不能代谢糖酵解中的氮源D-甘露糖胺,抗性菌株6-11还不能代谢尿素循环中的氮源L-鸟氨酸。烟草赤星病菌能代谢24.74%、85.26%、97.14%、89.83%的供试碳、氮、硫、磷源;具有广泛渗透压和pH适应能力;具有脱羧酶活性而无脱氨酶活性;能在高达10%氯化钠、6%氯化钾、5%硫酸钠、20%乙二醇、6%甲酸钠、6%尿素、12%乳酸钠、200 mmol·L^-1 磷酸钠、100 mmol·L^-1硫酸铵、100 mmol·L^-1硝酸钠和20 mmol·L^-1亚硝酸钠的渗透液中正常代谢,不能在20~200 mmol·L^-1的苯甲酸钠渗透液中代谢;其pH适应范围为3.5~10.0,最适约为6.0。研究结果有助于了解烟草赤星病菌的营养需求特性、渗透压和pH环境适应力,同时从代谢表型上揭示了赤星病菌对嘧菌酯抗性的潜在机理。     

甘肃陇南感病小檗在小麦条锈病发生中起提供(初始)菌源作用的直接证据

 陇南是中国小麦条锈菌易变区、小麦条锈病的常发流行区和防治的关键地区。明确陇南小麦条锈菌转主寄主小檗在小麦条锈病发生中的作用,对阐释该地区小麦条锈菌新小种产生的来源和指导小麦条锈病的综合防控具有重要意义。本研究从陇南春季自然受锈菌侵染的堆花小檗及其邻近的小麦上分离获得小麦条锈菌菌系,19个来自发病小檗的单夏孢子堆菌系在中国小麦条锈菌鉴别寄主上产生5个不同毒力类型VP1~VP5,均为新小种;在近等基因系和载体品种组成的鉴别寄主上产生17个不同毒力类型。29个来自邻近发病小檗的小麦上条锈菌菌系在中国小麦条锈菌鉴别寄主上产生了10个不同的毒力类型VP1~VP10,均为新小种;在近等基因系和载体品种组成的鉴别寄主上产生了24个不同的毒力类型。两个小麦条锈菌群体享有共同的毒力类型VP1~VP5,同时来自发病小檗上菌系的一些毒力类型不同于小麦上的毒力类型。主坐标分析(PCoA)和毒性表型聚类分析表明来自于自然受锈菌侵染小檗及其邻近小麦上的小麦条锈菌存在菌源交流。综合研究表明在自然条件下,陇南小麦条锈菌在野生感病小檗上进行有性生殖是常年发生的,感病小檗在新小种产生和在陇南小麦条锈病的发生中起提供菌源的作用。因此,在陇南小麦条锈病的综合治理策略上加强对小檗的处理,降低新小种产生速率和品种抗性丧失速率,从而延长品种使用年限,同时减少新小种向东部广大麦区传播,保障小麦生产安全。     

源自陕、甘野生小檗的小麦条锈菌有性生殖后代的毒性分析

 小麦条锈病是我国最具毁灭性的小麦病害之一,其流行常常造成小麦严重减产。种植抗病品种是防治该病害最经济、有效和环保的措施。但是,由于新毒性菌系的出现,抗病品种在种植短短数年内便“丧失”其抗病性。研究证实病原菌毒性变异产生新菌系是导致小麦品种抗病性“丧失”的根本原因。近年来,随着小麦条锈菌转主寄主小檗的确定,发现自然条件下我国小麦条锈菌在野生小檗上可以完成有性生殖。本研究通过对2015年自然发病小檗小麦条锈菌的分离及其单夏孢子堆纯化,利用中国鉴别寄主进行了毒性测定分析。从陕西、甘肃两省的3种感病小檗共分离获得小麦条锈菌菌系8个,其中有1个菌系与已知小种Su11-126的毒性完全匹配,其余7个为新菌系;93个单夏孢子堆群体可分为47个不同的致病类型,包括14个已知小种类型,33个新小种类型;有56个菌系与已知小种的毒性完全匹配,37个为新小种。本研究再次获得了条锈菌自然条件下存在有性生殖并因此导致新菌系产生的证据,证实了野生小檗在我国小麦条锈菌的生活史和病害循环中具有作用。     

林芝地区小麦条锈菌转主寄主小檗的鉴定与分布

西藏自治区是我国小麦条锈病发生与流行相对独立的一个区系,小麦条锈病是严重影响西藏小麦安全生产的重要病害之一,林芝地区是西藏自治区小麦条锈病重要的常发区和流行区。已有研究证实,小檗是小麦条锈菌的转主寄主之一,并在我国小麦条锈菌致病性变异产生新菌系和小麦条锈病的发生过程中起作用。林芝地区小檗种类较多,但目前对林芝地区小檗是否能作为小麦条锈菌的转主寄主缺乏相关的研究和报道。本文针对小麦条锈病常发区的西藏林芝地区小檗资源进行了调查,对小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了鉴定。结果表明6种小檗在林芝地区常见且分布广泛,均是小麦条锈菌的转主寄主。这对进一步研究西藏小麦条锈病的发生、流行与病原菌致变性变异起着重要作用。     

普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17抗条锈病基因的标记定位

 采用我国当前流行的小麦条锈菌小种和重要致病类型, 在常温条件下对普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17进行苗期抗条锈性鉴定, 并用当前主要流行小种CYR32对H9015-17与铭贤169的杂交后代及其双亲进行抗条锈性遗传分析, 以揭示H9015-17抗条锈性遗传基础。结果显示, H9015-17对小麦条锈菌小种CYR31、CYR32、CYR33和致病类型Su11-4、Su11-7、V26、Su11-11均有良好的抗病性, 对当前主要流行小种CYR32的抗病性由1对显性基因控制, 暂命名为YrHua1。 采用分子标记定位技术,筛选到5个与抗病基因YrHua1连锁的RGAP标记(M1、M2、M3、M4和M5)和1个SSR标记(Xgwm292),这些标记与抗病基因YrHua1的遗传距离分别为17.3、15.7、13.1、3.3、2.9和11.2,并将基因YrHua1定位在小麦染色体5DL上。研究结果将为分子标记辅助选择改良小麦抗条锈性提供宝贵的种质材料,建议在抗病育种加以利用。     

小麦凝集素类受体激酶TaLecRLK1的鉴定及抗锈病功能分析

凝集素类受体激酶(lectin receptor-like kinase, LecRLKs)是一类在植物应答多种生物/非生物胁迫中发挥重要作用的类受体激酶。本研究在小麦与条锈菌互作的转录组中筛选到1个在小麦与条锈菌非亲和互作中显著上调表达的LecRLKs基因TaLecRLK1。该基因全长2 292 bp,编码蛋白含有1个胞外信号肽、B-lectin结构域、PAN＿AP结构域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。qRT-PCR分析表明：TaLecRLK1在小麦与条锈菌非亲和互作早期诱导表达,在烟草及小麦原生质体中瞬时表达,TaLecRLK1-GFP定位在细胞膜上。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)沉默TaLecRLK1,接种无毒性条锈菌小种CYR23后,沉默叶片表面产生少量夏孢子堆,组织学观察发现沉默植株中条锈菌菌丝长度增长、侵染点附近活性氧积累面积减少;TaPR1、TaPR2、TaPR5的表达受到抑制,TaCAT和TaSOD则被迅速诱导表达。综上所述,TaLecRLK1对小麦抗条锈病起到正调控作用。     

应用real-time PCR评价三种杀菌剂对小麦条锈病的防治效果

为更加精确有效地评估杀菌剂对小麦条锈病的防效,本研究利用real-time PCR检测潜育阶段的分子病情指数(molecular disease index,M DI)并结合田间病情分析,对三种杀菌剂的防效进行评价。春季返青后在品种铭贤169和京0045试验小区的诱发中心接种小麦条锈菌夏孢子,待充分发病后将其铲除。设置播种前2%立克秀拌种,接种后21和28 d分别喷施25%阿米西达和30%苯甲-丙环唑1 500倍液三种处理。发病后调查不同处理的普遍率和严重度,计算病情指数和AUDPC。结果表明,阿米西达和苯甲-丙环唑对小麦条锈病具有良好的防效且能够明显抑制发病中心的扩展,而经立克秀拌种对该病害的防治效果和发病中心扩展的抑制作用均不理想。对京0045于发病中心接种后24和33 d采样,经双重real-time PCR定量检测,计算MDI。结果显示潜育检测获得的M DI与AUDPC之间均具有极显著的相关性;阿米西达和苯甲-丙环唑对潜育期小麦条锈菌的扩展具有明显的持续抑制作用,而立克秀拌种仅对小麦条锈菌潜伏初期的扩展表现出一定的抑制作用。