松材线虫入侵对马尾松树光合特性的影响

[目的]明确松材线虫入侵对马尾松树针叶光合特性、光合响应曲线、主要光合响应指标及碳氮元素含量的影响,以期在光合生理水平上提供松材线虫病的早期快速诊断技术,为林业管理者采取快速防治措施提供科学的理论依据。[方法]本研究选取健康期、感病中期和感病末期马尾松树为研究对象,利用Li-6400XT便携式光合测定仪和稳定同位素质谱仪,分别测定不同感病阶段马尾松树针叶光合特性及所测针叶样品的C%、N%和δ~(13)C含量。[结果]健康马尾松树在松材线虫胁迫条件下,可显著降低其针叶的净光合速率、蒸腾速率及气孔导度,其数值大小均表现为:健康期感病中期感病末期;不同感病阶段马尾松的暗呼吸速率数值之间的差异也达到极显著水平,其数值的大小表现为:感病中期健康期感病末期;健康期马尾松的光补偿点显著低于感病中期的光补偿点,但是其光饱和点显著高于感病中期的光饱和点。此外,不同感病阶段马尾松树针叶的平均C素含量变化不大,但平均N素和平均δ~(13)C含量则会显著下降。[结论]松材线虫侵染健康马尾松树后,可降低其对外界光照条件的适应能力,致使其光合特性显著下降;感病马尾松树针叶N素损失是导致马尾松光合能力显著下降的一个主要原因;感病马尾松树针叶气孔导度下降是导致其针叶δ~(13)C含量下降的主要原因,同时亦说明松材线虫的入侵会显著降低马尾松树针叶的水分利用效率。     

基于高通量转录组测序筛选马尾松抗松材线虫病相关基因

[目的]研究马尾松抗松材线虫病相关基因,为解析马尾松抗性机理和高抗马尾松早期选择提供理论依据。[方法]对高抗和易感2种马尾松基因型接种松材线虫,在接种后第1、15和30天取样进行转录组高通量测序,通过对高抗和易感马尾松差异基因识别以及富集分析,以筛选与抗松材线虫病相关的组成型差异基因。[结果]对高抗和易感马尾松接种松材线虫后的转录组进行比较,在接种后第1、15和30天分别获得2 866、679和1 657个差异基因,且在接种松材线虫后不同时间点间,共有差异基因相对较少。对差异基因进行GO富集分析,结果显示:在接种后第1、15和30天,最显著的生物学进程是氧化-还原过程,而GO项刺激反应、转录调节以及香叶基二磷酸代谢过程也显著富集。对这几类GO项相关基因进一步分析,发现接种后3个时间点GO项刺激反应中共包括26个R基因,除了2个R基因外,其它R基因表达皆为组成型,在接种松材线虫和对照间差异不显著,而GO项转录调节中仅2个差异基因被nr注释为ERF转录因子,其余为未知基因。接种松材线虫后,ERF转录因子在高抗马尾松上的表达量始终高于易感马尾松上的表达量,且在接种松材线虫和对照间表达量变化不显著,也为组成型基因表达。GO项香叶基二磷酸代谢过程中,GGPPS 3个基因也在高抗马尾松上具有更高表达量,为组成型基因表达。这些基因中TIR-NBS-LRR基因(c65785.graph_c0)、ERF转录因子(c78073.graph_c0)和3个GGPPS基因在高抗马尾松中表达量较高,而在易感马尾松中表达量较低,甚至为0,可作为开发分子标记的候选基因用于鉴定抗性马尾松。[结论]高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1天其表达量差异达到显著水平的基因最多,其中,LRR基因、ERF转录因子和GGPPS与马尾松的抗性相关,部分TIR-NBS-LRR基因、ERF转录因子和GGPPS有望被开发为鉴定高抗马尾松的分子标记。     

黑松和马尾松苗受松材线虫侵染后部分化学物质的响应

为研究松材线虫侵染对寄主植物生理生化物质代谢的影响,以黑松和马尾松4 5年生苗为实验材料,测定了接种松材线虫对2种寄主植物的营养物质和次生代谢物质含量的变化及其规律。结果显示:接种松材线虫初期,黑松和马尾松的总糖含量均较高,随接种时间的延长,总糖含量呈不断下降趋势;黑松的可溶性糖含量一直降低并明显低于对照,马尾松的可溶性糖含量在侵染前期与对照相比变化不明显,而15 d后快速降低;黑松和马尾松的可溶性蛋白含量侵染前期均低于对照,后升高,再降低;黑松的单宁含量明显高于对照,马尾松的单宁含量接种第1天略低于对照,第3天后开始升高;黑松和马尾松的总酚含量均在侵染前期高于对照,而后降低。这些物质的变化趋势显示松材线虫侵染不同寄主植物的生理反应。     

马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同器官间显著下调表达的时间点存在差异;同时,不同器官pmCaM表达量变化均存在特异的随时间发展的波动特征,其中发现,根茎pmCaM在松材线虫接种45 min时均处于表达量高峰。本研究结果显示pmCaM表达响应了松材线虫侵染,揭示pmCaM可能参与了调控松材线虫-马尾松互作早期的钙信号响应。     

松材线虫侵染前后马尾松树体内微生物多样性分析

[目的]以浙江省松材线虫病疫区健康和枯死马尾松(Pinus massoniana?Lamb.)为研究对象,探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染前后马尾松树体内微生物群落结构的差异,同时为利用马尾松内生微生物防治松材线虫病积累微生物种质资源.[方法]采用组织分离法、形态学和分子生物学相...     

松材线虫侵染对马尾松体内有机酸及酶的影响

以马尾松为实验材料,研究松材线虫侵染对马尾松体内苯甲酸含量、水杨酸含量、苯甲酸羟化酶及水杨酸羟化酶的活性的影响。结果表明：苯甲酸和水杨酸2种有机酸含量与马尾松松材线虫病的病情密切相关,并随着病情的发展,其含量逐渐升高,到病重（第12天）后下降;苯甲酸被松材线虫侵染后的马尾松体内苯甲酸羟化酶的活性持续上升,于病重前（第9天）达到最大,以后持续下降,而水杨酸羟化酶的活性变化不明显。     

针叶矿质营养元素与松材线虫病感病的关系

用ＩＣＰ仪测定１０个有代表性种源的马尾松针叶的矿质营养元素,同时对这１０个种源接种松材线虫,结果发现不同种源的抗性差异显著。马尾松不同时期的矿质元素含量与马尾松对松材线虫的抗性关系不一样,其中休眠期针叶内的Ｍｎ,Ｆｅ,Ｃｏ含量与抗性呈正相关,而Ｎｉ含量与抗性呈负相关。     

MicroRNA转录后调控欧美杨R2R3-MYBs抗锈菌表达

[目的]强致病锈菌亲和型树种欧美杨适合做寄主感病分子机理研究。研究表明转录因子及其调控miRNA在杨树抗/感病过程中起重要的信号传导和调控作用,决定杨树与锈菌的亲和性。为深入研究杨树感病性,对欧美杨R2R3-MYB转录因子及其调控miRNA进行研究。[方法]构建锈菌侵染和未侵染miRNA组、降解组文库和基因表达谱文库,进行高通量测序。对基因表达谱结果进行生物信息学分析鉴定R2R3-MYBs,根据miRNA组和降解组数据确定R2R3-MYBs调控miRNA。应用定量PCR技术鉴定候选R2R3-MYBs和其调控miRNA的表达量。[结果]共鉴定到230个欧美杨R2R3-MYBs,其中55个R2R3-MYBs在锈菌侵染和未侵染叶片间表达量差异显著,其余表达量变化不显著。基于降解组,共鉴定到由22个miRNA调控18个R2R3-MYBs的86个转录后调控关系。定量PCR结果表明PC-3p-2521022_1与Pnd MYB173存在转录后负调控关系。预测的R2R3-MYB靶基因涉及水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸等多个植物激素抗性路径。[结论]E4强致病锈菌侵染导致亲和型树种欧美杨23.9%的R2R3-MYBs表达量发生变化,锈菌侵染不但可以影响R2R3-MYBs的表达量,还可以启动或关闭R2R3-MYBs的表达。欧美杨在E4强致病锈菌胁迫条件下,R2R3-MYBs转录后主要受miR159和miR858家族的miRNA调控。     

miRNA在调节植物抗逆等生理功能中的作用

植物microRNA（miRNA）是一类约21-24个核苷酸组成的小分子RNA。在细胞核中将非编码的茎环结构的单链RNA前体（pri-miRNA）加工成miRNA/miRNA＊双链,然后运到细胞质中解开双链。成熟的miRNA通过形成miRNA诱导的沉默复合物（miRNA-induced silencing complex,miRISC）与靶标mRNA互补配对结合,并对其进行剪切或抑制翻译,实现对靶标基因的负调控。miRNA在抗逆反应、植物发育、信号转导等方面起着重要作用。     

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐久型幼虫(L_Ⅳ)携带的香茅醇假单胞杆菌(Pseudomonas citronellolis)分离与鉴定

[目的]目前有关松材线虫与伴生细菌的关系及伴生细菌的病原作用是松树枯萎病研究的重点。为了揭示松材线虫与伴生细菌之间存在的密切关系,作者对松材线虫L_Ⅳ幼虫携带的细菌进行了分离鉴定。[方法]根据培养性状和16S rDNA序列同源性以及系统发育学等方面进行分析鉴定。[结果]确定L_Ⅳ幼虫携带的是香茅醇假单胞杆菌(Pseudomonas citronellolis),携带率为100%;每条L_Ⅳ幼虫携带量在1.4×10~5~4.5×10~5。L_Ⅳ幼虫生活在松褐天牛体内,是引起松材线虫病侵染流行的唯一虫态;新发现的香茅醇假单胞杆菌能分解纤维素及降解或合成萜烯和酚类化合物。[结论]L_Ⅳ幼虫携带香茅醇假单胞杆菌的发现,揭示了松树、松褐天牛、松材线虫、细菌同为一体的紧密关系,并为揭示松树枯萎病机制提供了一种新病原和重要的研究思路。     

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐久型幼虫(LIV)携带的香茅醇假单胞杆菌(Pseudomonas citronellolis)分离与鉴定

[目的]目前有关松材线虫与伴生细菌的关系及伴生细菌的病原作用是松树枯萎病研究的重点。为了揭示松材线虫与伴生细菌之间存在的密切关系,作者对松材线虫L_IV幼虫携带的细菌进行了分离鉴定。[方法]根据培养性状和16S rDNA序列同源性以及系统发育学等方面进行分析鉴定。[结果]确定L_IV幼虫携带的是香茅醇假单胞杆菌（Pseudomonas citronellolis）,携带率为100%;每条L_IV幼虫携带量在1.4×10⁵~4.5×10⁵。L_IV幼虫生活在松褐天牛体内,是引起松材线虫病侵染流行的唯一虫态;新发现的香茅醇假单胞杆菌能分解纤维素及降解或合成萜烯和酚类化合物。[结论]L_IV幼虫携带香茅醇假单胞杆菌的发现,揭示了松树、松褐天牛、松材线虫、细菌同为一体的紧密关系,并为揭示松树枯萎病机制提供了一种新病原和重要的研究思路。     

松材线虫Bxpel2基因的克隆及RNA干扰载体构建

[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T₇启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL^-1和1.152 mg·mL^-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础.     

基于马尾松反转录转座子序列的IRAP分子标记开发及应用

[目的]为了丰富马尾松遗传信息,开发更多适用于马尾松的新型分子标记。[方法]依据马尾松Ty1-copia类型和Ty3-gypsy类型反转录转座子RT序列的保守区域设计引物,建立了马尾松IRAP-PCR技术体系并以12个基因型个体为材料进行验证。[结果]42条引物中筛选出多态性丰富、重复性好的29条进行PCR扩增,共获得227条谱带,其中多态性条带207个,多态性比例为91.19%,平均观测等位基因数(Na)为1.911 9±0.284 1,有效等位基因数(Ne)为1.468 0±0.288 2,Nei’s基因多样性指数(H)为0.291 1±0.144 9,Shannon’s信息指数(I)为0.447 2±0.195 3;利用引物P-12、P-15或R-1,可以将栽培种与无性系两类区分开;P-2可作为核心引物,能将12份供试材料有效区分开来;采用IRAP标记构建了供试种质的DNA指纹图谱;供试种质的遗传相似系数为0.46 0.69,以相似系数为基础,进行UPGMA聚类分析,以0.57为阈值可将供试种质分为三类,其中无性系内不同材料间也存在较大的遗传变异。[结论]IRAP分子标记能有效地用于马尾松种质的鉴别与亲缘关系分析等相关研究。     

钙浓度对马尾松幼苗生长和生理特征的影响

[目的]在不同供Ca2+水平下对马尾松幼苗生长及生理特性进行研究,以确定适宜马尾松生长的钙浓度,为马尾松人工林培育及合理施用钙肥提供参考。[方法]以半年生马尾松幼苗为试材,采用温室内砂培,研究不同供Ca2+水平(0.0、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L~(-1)(CK))对马尾松生长及生理指标的影响。[结果]不同供Ca2+水平处理5个月后,在Ca2+水平为1.0、2.0 mmol·L~(-1)时,马尾松幼苗的株高增量和地径增量较高,其中,2.0 mmol·L~(-1)Ca2+水平的株高增量和地径增量最高。马尾松幼苗对Ca2+水平适应能力强弱顺序为2.01.00.43.00.04.0 mmol·L~(-1)(CK)。在不同生长期内,随着供Ca2+水平的增加,马尾松针叶中ROS(O2-产生速率、H2O2浓度)、MDA含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性、抗氧化物质(GSH、As A)含量、脯氨酸含量均先降低后增加,最小值均在1.0 mmol·L~(-1)或2.0 mmol·L~(-1)处理中;类胡萝卜素含量先增加后降低,其最高值均在2.0 mmol·L~(-1)处理中。马尾松幼苗的株高增量和地径增量与类胡萝卜素含量关系不明显,而与其他生理指标均呈显著负相关。[结论]马尾松幼苗适宜在1.0 2.0 mmol·L~(-1)Ca2+水平的环境中生长。在马尾松林地中,应对土壤有效钙含量进行测定,并结合植株的生长和生理特征进行综合评价后,科学合理施肥以提高生产力。     

基于cpDNA rps16序列分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐的遗传关系

【目的】通过测序法分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐在叶绿体rps16序列上的遗传差异,旨在分析三者之间在叶绿体基因上的变化特点和规律,探讨其种间的遗传关系。【方法】选取兰考泡桐、白花泡桐和毛泡桐各15个样本,对其提取的DNA用PCR扩增获得特异片段,并将其纯化与测序。利用软件Clustal X 2.0对所得序列进行排序;运行MEGA 4软件,进行多序列比对,分析其序列特征,并计算出K2P遗传距离。【结果】(1)对获得的rps16序列进行测定分析,得兰考泡桐序列长度分别为932 933 bp;白花泡桐序列长度为932 bp;毛泡桐序列长度分别为916918 bp。对所得rps16序列进行排序后的长度为938 bp,平均GC含量为34.31%。3个种所代表的个体之间共有10个变异位点,占整个序列长度的1.07%。其中有9个变异位点属于碱基插入或缺失类型,占变异位点总数的90%,占整个序列长度的0.96%。有1个变异位点属于碱基替换类型,占整个变异位点总数的10%,占整个序列长度的0.11%。(2)整个rps16片段的序列共有10个变异位点,其中兰考泡桐与白花泡桐在总的变异位点上,具有一致的碱基位点9个,占总变异的90%。而兰考泡桐与毛泡桐相比,没有相同的碱基。【结论】根据三种泡桐的rps16序列的序列特征和变异位点的分析,表明在叶绿体遗传方面,兰考泡桐具有与白花泡桐更多相似的遗传物质,其亲缘关系较近。综上所述,推测兰考泡桐与白花泡桐可能来自同一母系遗传。     

三峡库区马尾松细根分解及其养分释放

[目的]为认识马尾松细根对土壤养分库的贡献,[方法]本研究以三峡库区秭归县九岭头林场马尾松为研究对象,采用埋袋法进行细根分解实验,探讨0.5 mm、0.5 1 mm和1 2 mm细根的分解动态和养分释放(C、N、P、K、Ca、Mg)。[结果]结果表明:(1)细根分解368 d后,0.5 mm、0.5 1 mm和1 2 mm细根干重残留率分别为66.0%、72.0%和74.33%,且细根分解速率随直径增加而减小;(2)细根分解速率与土壤温度呈显著正相关关系(p0.05),与土壤湿度呈正相关关系(p0.05);(3)细根C、K和Mg元素迁移模式表现为释放,Ca元素表现为富集;(4)细根N、P元素在不同径级细根中迁移模式不同,0.5 mm细根N、P元素表现为释放,0.5 2 mm细根N、P元素在分解过程中出现富集阶段。[结论]马尾松细根分解与土壤温度和直径大小显著相关,其中分解与温度呈正相关,与直径呈负相关;在细根分解过程中,马尾松细根不同直径大小的不同养分元素的表现状态不一致,或富集,或释放。     

基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

杨树PIF基因家族成员表达模式研究

[目的]为探究光敏色素相互作用因子(PIF)基因在杨树生长发育中的功能。[方法]利用生物信息学方法预测了杨树基因组中的PIF基因家族成员并对各成员的基因结构、保守基序进行了系统分析;在此基础上,采用实时荧光定量PCR技术检测了PIF成员在不同组织及低温、干旱和Na Cl胁迫下的表达模式。[结果]表明:杨树基因组中至少含有10个Pt PIF成员,这些成员在进化上相对保守,均具有典型的b HLH结构域。基因表达分析显示:Pt PIF基因在杨树不同组织及不同非生物胁迫条件下存在明显的表达差异。[结论]杨树Pt PIF基因家族包含10个成员参与不同的生物学过程,研究结果将为深入解析杨树Pt PIF基因的功能奠定了基础。     

松褐天牛在马尾松树干上的分布规律

作为松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)的最重要传播媒介,松褐天牛已成为控制松材线虫病的重点。明确松褐天牛各虫态在不同地区寄主树干上的分布,对因地适宜地释放天敌昆虫有着重要意义。为此,本研究通过解剖受害马尾松,结合林间调查,系统地研究了松褐天牛产卵刻槽、幼虫和蛹在马尾松树干上的分布规律。结果表明:松褐天牛产卵刻槽主要分布在树干的2.5 6.5 m范围内,刻槽数量与树干高度和胸径显著相关;松褐天牛幼虫数量与树干胸径关系不显著;多数蛹室位于侵入孔正上方,少数蛹室位于侵入孔下方,两种蛹室数量差异显著;两种蛹室与侵入孔中心的平均距离分别为3.93 cm和4.39 cm,两者之间差异不显著;并建立了松褐天牛幼虫在马尾松树干上的垂直分布模式图。本研究表明了松褐天牛种群密度与寄主树木大小的关系,为释放天敌进行生物防治提供了基础。     

小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析

[目的]本研究为了探讨在植物发育和抗逆过程扮演着重要角色的MYB转录因子的潜在功能。[方法]利用拟南芥MYB转录因子家族蛋白序列(At MYBs)和已报道的蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子家族蛋白序列(Pe MYBs),采用本地化软件BLASTP对小兰屿蝴蝶兰全基因组数据库进行搜索,并利用Pfam数据库验证MYB结构域,获得小兰屿蝴蝶兰MYB转录因子家族编码序列(Pe MYBs)125条,包含1R-MYB结构域的Pe MYBs蛋白序列27条,R2R3-MYB结构域96条,R1R2R3-MYB结构域2条。重点对96条R2R3-MYB结构Pe MYBs蛋白序列特点进行生物信息学分析。[结果]依据拟南芥的分类标准将小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB类转录因子划分为20个亚群,预测获得同源性较高的直系和旁系同源基因;各基因在四种器官(花、叶、根、茎)中的表达情况各异,39个Pe MYBs基因在4种器官中均表达,48个基因在不同器官中有特异性不表达现象,一些基因呈现器官特异性表达特点,推测其可能参与相应组织特定发育时期的调控。[结论]预测获得125条Pe MYBs蛋白序列,并对部分Pe MYB转录因子可能的调控功能进行了预测,将为细致研究蝴蝶兰MYB转录因子调控植物生长发育和逆境胁迫响应的分子机理提供一定的数据基础。