应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒

应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒(LMoV)进行RT-PCR检测.结果表明,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段.将感染LMoV组织总RNA以10倍梯度稀释成不同浓度检测,特异引物检测的灵敏度为10-4,简并引物的灵敏度为10-3.对特异引物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为90%～99%,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠.     

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为28～33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT-PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约600bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM109,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达96% ) ,最低检出病毒核酸含量为5ng ,表明应用RT-PCR检测香石竹斑驳病毒是可行的     

RT-PCR检测番茄不孕病毒

根据番茄不孕病毒 (TAV)RNA3上外壳蛋白基因序列设计、合成引物 ,以感病组织和健康组织总RNA为模板 ,进行cDNA合成和PCR扩增 ,结果从感病组织中扩增出与预期的6 42bp大小一致的目标片段 ,而健康组织无此扩增产物 ;将PCR产物插入 pGEM T载体克隆并测序 ,序列分析表明与TAV不同株系的序列同源性达到 96 2 %以上 ;将感病组织总RNA以 1 0倍梯度稀释成不同浓度 ,测出RT PCR检测TAV的灵敏度为 1 0 -5 ;PCR产物克隆作为RT -PCR反应的阳性对照 ,解决了毒源保存和传播的问题 ,从而建立了TAV快速、灵敏、准确的RT -PCR鉴定和检测技术     

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.     

美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料,根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列设计2对特异性引物(外侧引物1对、内侧引物1对),建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法,并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示,该方法特异性强,且灵敏度高于常规PCR,是常规PCR的1 000倍,表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测,适用于口岸快速检测CaYMV。     

加拿大进境大豆上检出菜豆荚斑驳病毒

本研究采用DAS ELISA、IC RT PCR及序列测定方法,对加拿大进境大豆种子进行菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）检测,结果表明,BPMV的DAS ELISA和IC RT PCR检测结果均为阳性,且PCR扩增产物序列与已报道的BPMV基因序列相似性达97%以上,而SMV的DAS ELISA和IC RT PCR检测结果都为阴性。综合血清学、分子生物学检测结果,确认该批大豆携带有菜豆荚斑驳病毒。     

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒

 利用改进的CTAB法提取出优质的草莓总RNA,可以稳定地进行RT PCR。针对草莓斑驳病毒(SMoV)基因组序列设计筛选引物,对病毒基因组的不同区域进行扩增,扩增产物经克隆、测序证明为SMoV的特异片段,与国外序列的同源性为91%~97%。为了监测RNA的质量和RT PCR反应的正常进行,在检测体系中引入线粒体NADH脱氢酶基因ND2亚基作为内标,内标引物跨越内含子区域,只对剪接后的mRNA进行特异扩增,可以较好地监测整个检测过程。在国内首次建立了SMoV的RT PCR检测体系,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,对草莓病毒指示植物和草莓栽培品种都可以进行快速稳定的检测。     

利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因（CP基因）保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。     

RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒９ＰＮＲＳＶ）,根据该病毒ＲＮＡ３序列设计引物,对感病和健康组织总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果从感病组织中扩增出了大约４５０ｂｐ的目的片段,而健康组织中无此扩增带。将此ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ载体也能转化大肠杆菌ＤＨ５５α菌株,得到了含有目的片段的重组子。并采用双脱氧终止法进行序列配美国报道的李坏死环斑病毒ＲＮＡ３序列对应部分核苷酸基本一致,这表     

恩施地区烟草病毒病的电镜诊断与RT-PCR鉴定

采集湖北省恩施地区疑似感染烟草病毒病的新鲜烟叶样品,提纯获取混合样品病毒粒子悬浮液,采用悬滴法进行负染,通过电镜观察对病原物进行初步鉴定。结果显示,病毒粒子悬浮液中存在大量线状、杆状与球状形态病毒粒子。进一步提取混合样品总RNA,使用马铃薯Y病毒属通用引物,TMV、CMV外壳蛋白序列特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物回收克隆用于测序,经BLAST程序与GenBank进行比对,感病样品中检出TMV、CMV、PVY,与电镜所观察到的病毒粒子形态结构一致。