甘蓝型油菜CO 同源基因功能初步研究

CONSTANS（CO）基因是植物光周期途径中重要的转录调控因子。为了探究甘蓝型油菜CO 同源基因的 功能，以拟南芥CO 基因的CDS序列为参考序列，从甘蓝型油菜品种Westar的cDNA中分离得到CO 的两个同源基因 （基因编号：BnaC09g41990D 和BnaA10g18430D），命名为BnaC09CO 和BnaA10CO。构建双35S超表达载体转化哥 伦比亚拟南芥，得到超表达转基因株系，观察表型并进行定量分析。结果表明超表达转基因株系的开花时间比野 生型早3~5 d，BnaC09CO、BnaA10CO、FT 与SOC1 表达量较野生型显著升高。说明在长日照条件下甘蓝型油菜 BnaC09CO 和BnaA10CO 基因起到了与CO 基因类似的作用，能够引起拟南芥FT 和SOC1 的上调表达，从而促进拟南 芥的开花。     

甘蓝型油菜SERK基因家族的鉴定与系统进化分析

体细胞胚胎发生类受体激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）与植物体细胞胚发生，尤其是与植物非生物逆境胁迫响应有关。为鉴定甘蓝型油菜中BnaSERK基因家族成员、揭示其进化关系及其与油菜盐/旱胁迫的响应，利用生物信息学方法对甘蓝型油菜品种中双11的SERK家族成员、基因结构、进化关系、选择压力等进行系统分析，并初步分析了部分BnaSERK基因在盐/旱胁迫下的表达响应模式。结果表明：在甘蓝型油菜基因组共鉴定到24个BnaSERK基因，它们不均等地分布在15条染色体上，可分为3个亚族，具有相对保守的基因结构和保守基序，且含多种与激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。共线性分析表明，甘蓝型油菜和拟南芥、白菜、甘蓝分别有14对、44对和32对基因表现出共线性。基于比较基因组学研究，甘蓝型油菜BnaSERK基因在经历多倍体化之后，出现了不同程度的丢失现象。分析表明，BnaSERK基因家族在芸薹属物种间的进化相对保守。盐/旱胁迫下的5个BnaSERK基因在叶片中的表达模式分析结果显示，BnaA07g29610D、BnaC01g43240D、BnaCnng07810D基因在盐胁迫下表达量上调，而BnaA01g23070D、BnaA07g23390D基因则表现为下调；BnaA07g23390D、BnaA07g29610D基因在干旱胁迫下表现为上调表达，而BnaC01g43240D、BnaCnng07810D、BnaA01g23070D基因呈下调趋势。表明BnaSERK基因可能在油菜响应盐/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。     

HMA基因家族在芸薹属AC基因组中的进化分析

为研究芸薹属AC基因组重金属转运ATP酶(HMA,heavy metal transporting ATPase)参与的金属转运机制,利用白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组数据对HMA基因进行全基因组水平鉴定,并分析其在芸薹属AC基因组中的进化。结果显示,在芸薹属AC基因组中共鉴定到50个HMA基因,其中白菜14个、甘蓝13个、甘蓝型油菜23个(A亚基因组11个,C亚基因组12个),并且HMA基因在三个物种中均存在不均匀加倍的现象。这50个基因分属于P_1B-1、P_1B-2、P_1B-4三个亚族,在蛋白保守序列分布、蛋白理化性质、基因结构和启动区顺式作用元件等方面不同亚族之间各有差异,但同一亚族的基因在组织表达特异性方面也存在较大的差异。还发现Bra003110、Bol030251、BnaA10g06240D、BnaC09g28870D,BnaC09g11230D、BnaC04g20290D、BnaA09g10950D和Bra027641几个与At HMA5同源的基因,在多个方面较At HMA5发生了较大的变异,可能会导致这些基因在芸薹属作物中延伸出不同于At HMA5的功能。在芸薹属AC基因组HMA基因中发现的GICCSME和GICCPSE新变异类型,不同于拟南芥中的GICC(T/S)SE功能位点,也可能导致相应的基因出现新的功能变异。本研究为从芸薹属AC基因组中选择特异性金属离子转运的HMA基因提供生物信息学参考,对进一步解析芸薹属植物中HMA基因参与的金属离子转运机制具有重要的指导意义。     

甘蓝型油菜中5个脂酰-ACP硫酯酶基因的克隆与功能初步分析

为了解影响油菜种子含油量的关键基因，从高含油量（HO）和低含油量（LO）甘蓝型油菜中克隆了5个脂 酰-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）的基因。序列分析表明这5个FAT 基因在HO和LO油菜基因组之 间没有序列差异。5个FAT 基因分别命名为：BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c、BnaC.FATB.a 和BnaA.FATB. b。分析表明，HO种子中5个FAT 基因的表达水平显著高于LO种子。异源表达结果显示，5个FAT 基因的所有酵母 转化子的含油量均显著增加，并且它们的脂肪酸组成均发生了变化。将这5个FAT 基因转化到拟南芥中进行进一 步的功能分析。5个转基因材料T1种子含油量均显著增加；BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c 转基因株系中 的饱和脂肪酸含量显著降低，而不饱和脂肪酸含量均显著增加；相反，在BnaC.FATB.a 和BnaA.FATB.b 转基因材料 中，饱和脂肪酸含量显著增加，而不饱和脂肪酸含量显著降低。结果表明，这5个FAT 基因不仅可以增加拟南芥含 油量，而且可以改变脂肪酸组成比例。     

甘蓝型油菜转录因子FUS3的克隆、表达分析及其与脂肪酸组分的关系

 为了探讨油菜转录因子FUS3的功能及其与脂肪酸组分的关系，从甘蓝型油菜湘油15中克隆到BnaFUS3基因的两个拷贝BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3。它们的CDS区序列分别长927bp和948bp，编码309和315个氨基酸，氨基酸序列变异多发生在C端。转录因子BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3属于含B3结构域的蛋白家族，是亲水性蛋白，无跨膜区，均是膜外蛋白。系统进化树分析表明，BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3两者都是BraFUS3和AtFUS3的同源基因。荧光定量PCR分析表明，BnaA2.FUS3在根、茎、叶、角果皮中均有表达，在种子中相对稳定表达，但在角果皮25d达到峰值；BnaA6.FUS3为种子特异表达，在种子35d达到峰值；两者在角果皮中表达量均呈“M”形趋势。分析脂肪酸积累规律与BnaFUS3表达关系发现，授粉30d后，BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3表达迅速升高，此时各脂肪酸也进入快速增长期；授粉后45d~50d时，两拷贝表达量变化较小，脂肪酸积累亦进入缓慢增长期，并趋于平稳。表明BnaFUS3在甘蓝型油菜的胚胎形成和发育中具有重要影响，对脂肪酸的合成和油脂积累起到重要作用。     

甘蓝型油菜脂肪酸碳链延长酶BnaA.FAE1与BnaC.FAE1的底物特异性分析

为提供信息改良油料种子脂肪酸,研究脂肪酸碳链延长酶1（FAE1）的底物特异性,将甘蓝型油菜A、C基因组的BnaA.FAE1和BnaC.FAE1分别在亚麻荠种子中表达。其转基因种子中山嵛酸与芥酸含量的比值（C22:0/C22:1）分别为0.18和0.88,表明BnaA.FAE1对单不饱和脂肪酸亲和力较高,而BnaC.FAE1则对饱和脂肪酸亲和力较高,这种差异在各转基因世代表现稳定。通过分析T3转基因家系种子中酰基辅酶A（Acyl-CoAs）的组成,进一步证明了上述结论。但是在拟南芥中分别异源表达上述基因,并没有观察到类似的底物特异性差异。在甘蓝型油菜祖先种,白菜型油菜和甘蓝种子中调查其C22:0/C22:1比值,同样未发现其FAE1底物特异性存在差异。综上认为BnaA.FAE1和BnaC.FAE1在亚麻荠中存在底物特异性。     

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因(负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因)家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM(隐马尔科夫)模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。     

甘蓝型油菜PPR家族生物信息学分析与新疆野生油菜候选育性基因克隆

通过隐马尔可夫模型从甘蓝型油菜基因组中获取1079条PPR家族蛋白序列,使用拟南芥PPR家族特征模型对其进行分类,同时进行聚类、染色体分布、亚细胞定位预测、功能注释等分析。结合不育系与恢复系分子标记筛选了定位于C09染色体的PPR基因GSBRNA2T00094406001(命名为Bn PPR_C09)为新疆野生油菜潜在育性调节基因。通过分子克隆的方法从新疆野生油菜不育系1193A和恢复系1193R中分别克隆获得了长度为2514bp的c DNA序列,序列分析显示来源于1193A的Bn PPR_C09基因(Bn PPR_C09b)相对源于1193R的Bn PPR_C09a在+1725 bp位置存在单碱基缺失,造成移码突变,二者预测蛋白的生物信息学分析显示Bn PPR_C09b蛋白的N端因为移码突变导致翻译过程在+1800位置终止,后续大量功能元件缺失,该位点的突变可能决定新疆野生油菜育性。     

甘蓝型油菜胚胎特异启动子pBnaA09g21960D的分析

为筛选甘蓝型油菜胚胎特异性表达启动子,以甘蓝型油菜冬性品种Darmor的叶片基因组为模板,克隆了Bna A09g21960D基因上游990bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明,该启动子除具有核心调控元件TATA box和CAAT-box外,还含多个组织特异性、激素、逆境、光合作用等表达相关的顺式作用元件,如ABRE、GCN4_motif、TGACG-motif等。为了验证该基因启动子的表达模式,构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181-p Bna A09g21960D,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色,结果表明GUS活性在拟南芥胚胎中特异表达,而在其他组织和器官均未表达,这表明p Bna A09g21960D具有驱动GUS报告基因在拟南芥种子胚胎中特异表达的潜质。这为该启动子在转基因技术提高油菜品质方面和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。     

甘蓝型油菜ＨＭＧ基因家族的生物信息学分析

为研究甘蓝型油菜HMG（high mobility group）基因家族的起源、进化和功能,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜和其近缘物种HMG基因家族进行鉴定,并对其进化、基因结构、组织表达、直系旁系同源基因进行系统分析。在甘蓝型油菜中鉴定到45个HMG家族成员,并根据进化树和基因结构将其分成5组。染色体定位发现,19条染色体中有18条染色体有HMG基因,说明该家族基因分布较广泛。在甘蓝型油菜与甘蓝、白菜和拟南芥分别鉴定到47、45和26个直系同源基因对。在甘蓝型油菜中鉴定到28个旁系同源基因对,而在其它3个物种中则比较少,这可能与甘蓝型油菜的多次基因组加倍有关。对45个甘蓝型油菜BnHMG基因在根和叶中的表达模式进行分析,结果显示,大多数基因在根和叶中均有表达,且呈现出不同的表达模式。     

Genome-wide association study identifies novel loci and candidate genes for drought stress tolerance in rapeseed

Rapeseed(Brassica napus)is one of the most important oil crops worldwide;however,drought seriously curtails its growth and productivity.Identifying drought-tolerant germplasm is an efficient strategy for addressing water shortages.Here,we phenotyped a panel of 264 B.napus accessions at full-bloom stage using water loss ratio(WLR)as drought-tolerant index.It identified 8 low-WLR and 6 high-WLR accessions,regarded as droughttolerant and drought-sensitive,respectively.Comparing with drought-sensitive accessions at the seedling stage,drought-tolerant accessions had shown better performance in maintaining fresh and dry weights,and performed the higher expression of drought-induced marker genes under drought stress.Subsequently,a total of 139 SNPs(single nucleotide polymorphisms)were identified associated with the WLR using a genome-wide association study(GWAS)among 264 B.napus accessions,with the largest number SNPs at chromosome A10,and 13 SNPs significantly were associated with the WLR(-log₁₀(p-value)>6).Furthermore,4 putative candidate genes(BnaC09.RPS6,BnaC09.MATE,BnaA10.PPD5 and BnaC09.Histone)were screened involving in drought tolerance in B.napus.Together,our results highlight the WLR's importance in drought tolerance and establish the foundation for improving WLR-associated drought tolerance in rapeseed.     

甘蓝型油菜NBS-LRR基家族的鉴定及密码子偏好性分析

NBS-LRR（nucleotide binding site and leucine rich repeat）是庞大且复杂的基因家族,对植物的抗病性具有非常重要的作用。为深入了解甘蓝型油菜NBS-LRR基因家族,合理开发利用基因资源,对甘蓝型油菜（Brassica na?pus L.）及相关物种的NBS-LRR基因进行了生物信息学分析,包括基因家族鉴定、系统进化分析、保守基序、基因结构、染色体定位以及密码子偏好性分析等。以拟南芥为参考,在甘蓝型油菜中鉴定到463个NBS-LRR基因家族成员,根据结构域将其分成TIR-NBS-LRR 和CC-NBS-LRR 两类,再分别细分为4 和8 个亚组。19 条染色体均有NBS-LRR基因,其中ChrC09上分布最多,达到53个;NBS-LRR基因以基因簇形式存在居多,可推测抗病基因NBSLRR发生了大规模片段复制。分析5个物种（甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、水稻和拟南芥）的NBS-LRR家族基因密码子 偏好性,结果发现,甘蓝型油菜抗病基因有效密码子数范围与甘蓝（B. oleracea L.）更加相近。然后进一步对甘蓝型油菜和白菜（B. rapa L.）与甘蓝的共线直系同源关系进行偏好性分析,并获得相同发现,推测甘蓝型油菜可能和甘蓝在抗病基因密码子的使用偏好上更为相似。     

甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能及进化分析

在高等植物中,线粒体转录终止因子(mTERF)影响线粒体或叶绿体的基因表达及植物对逆境的反应等生物学过程。为了研究甘蓝型油菜中线粒体转录终止因子1(mTERF1)的功能,本研究以甘蓝型油菜品种中双11号为材料,在A06连锁群上克隆了mTERF1,该基因编码285个氨基酸,含有5个mTERF功能结构域。利用生物信息学分析筛选到37个甘蓝型油菜mTERF家族蛋白,并进行了系统进化树、基因结构及染色体定位分析。此外,构建甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能互补表达载体,转化拟南芥mTERF1(soldat10)突变体后,拟南芥的表型恢复到野生型(Ler),说明该基因在油菜和拟南芥中具有保守的功能。本研究填补了油菜中线粒体转录终止因子研究的空白,为进一步探究油菜中线粒体转录终止因子的分子功能奠定了基础。