甘蓝型油菜中KCS6基因的克隆和功能分析

采用基因组步移和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,从甘蓝型油菜中双9号中克隆到了KCS6基因。甘蓝型油菜中KCS6基因有两个拷贝:BnKCS6c(与甘蓝的mRNA 99%同源)和BnKCS6a(与白菜的mRNA 99%同源)。这两个拷贝的编码区长度均为1 494bp,含有2个外显子,一个长1 045bp,另一个449bp。种子发育初期KCS6基因在角果皮和种子中表达量高,随着种子成熟表达量迅速降低。两个KCS6的转基因都可以在酵母中正常表达,但不能合成超长链脂肪酸,表明酵母中异源表达的KCS6蛋白没有活性,或KCS6蛋白不能以酵母的脂肪酸作为催化底物合成超长链脂肪酸。     

甘蓝型油菜BnCHI-1基因的克隆和表达特征分析

为了解Bn CHI-1基因的表达与粒色差异之间的关系,采用RACE技术从甘蓝型油菜黑籽系5B中克隆了Bn CHI-1全长c DNA序列和基因组序列。Bn CHI-1的DNA序列为1 809bp。965bp的Bn CHI-1 mRNA含有一个756bp的ORF,编码包含251个氨基酸的多肽。预测发现Bn CHI-1蛋白存在查尔酮-黄烷酮异构酶结构域,底物2S-柚皮苷的结合位点以及氢键网络氨基酸残基活性位点。Southern杂交结果表明在甘蓝型油菜中有6个CHI基因成员。RT-PCR揭示,甘蓝型油菜5B的11个器官组织均有Bn CHI转录,其在茎、叶、蕾和花中的转录水平比较高,其次为种子和根,在子叶中最低。比较1对近等基因系(黑籽系L1和黄籽系L2)中Bn CHI转录水平,发现在花蕾、花、花后20d种子和花后30d种子中,二者的转录水平没有显著差异,但在开花后10d的种子中,L2中Bn CHI转录水平显著低于L1中Bn CHI转录水平。     

甘蓝型油菜中5个脂酰-ACP硫酯酶基因的克隆与功能初步分析

为了解影响油菜种子含油量的关键基因，从高含油量（HO）和低含油量（LO）甘蓝型油菜中克隆了5个脂 酰-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）的基因。序列分析表明这5个FAT 基因在HO和LO油菜基因组之 间没有序列差异。5个FAT 基因分别命名为：BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c、BnaC.FATB.a 和BnaA.FATB. b。分析表明，HO种子中5个FAT 基因的表达水平显著高于LO种子。异源表达结果显示，5个FAT 基因的所有酵母 转化子的含油量均显著增加，并且它们的脂肪酸组成均发生了变化。将这5个FAT 基因转化到拟南芥中进行进一 步的功能分析。5个转基因材料T1种子含油量均显著增加；BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c 转基因株系中 的饱和脂肪酸含量显著降低，而不饱和脂肪酸含量均显著增加；相反，在BnaC.FATB.a 和BnaA.FATB.b 转基因材料 中，饱和脂肪酸含量显著增加，而不饱和脂肪酸含量显著降低。结果表明，这5个FAT 基因不仅可以增加拟南芥含 油量，而且可以改变脂肪酸组成比例。     

甘蓝型油菜脂肪酸碳链延长酶BnaA.FAE1与BnaC.FAE1的底物特异性分析

为提供信息改良油料种子脂肪酸,研究脂肪酸碳链延长酶1（FAE1）的底物特异性,将甘蓝型油菜A、C基因组的BnaA.FAE1和BnaC.FAE1分别在亚麻荠种子中表达。其转基因种子中山嵛酸与芥酸含量的比值（C22:0/C22:1）分别为0.18和0.88,表明BnaA.FAE1对单不饱和脂肪酸亲和力较高,而BnaC.FAE1则对饱和脂肪酸亲和力较高,这种差异在各转基因世代表现稳定。通过分析T3转基因家系种子中酰基辅酶A（Acyl-CoAs）的组成,进一步证明了上述结论。但是在拟南芥中分别异源表达上述基因,并没有观察到类似的底物特异性差异。在甘蓝型油菜祖先种,白菜型油菜和甘蓝种子中调查其C22:0/C22:1比值,同样未发现其FAE1底物特异性存在差异。综上认为BnaA.FAE1和BnaC.FAE1在亚麻荠中存在底物特异性。     

甘蓝型油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因BnHemd的克隆和功能分析

为探讨油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因Bn Hemd的功能及其与叶绿素合成的关系,促进光合效率和产量的提升,利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中双11号中该基因在A9和C8染色体上的两个拷贝进行编辑。从中双11号中克隆到基因Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd,CDS序列分别为885 bp和876 bp,均由9个外显子构成,各编码294和291个氨基酸残基。Bn Hemd蛋白性质与结构分析结果表明,甘蓝型油菜中基因Bn Hemd的两个拷贝的蛋白理化性质十分相似,均为不稳定蛋白,相对分子质量分别为31.97 k D和31.40 k D。系统进化树分析表明,Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd分别与白菜和甘蓝中的同源基因亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,Bn Hemd在中双11号的根、茎、叶、花蕾、种子和角果皮中均有表达,在角果皮和花蕾中的表达量远高于根、茎、叶。初步的功能分析结果表明,中双11号中该基因两个拷贝同时编辑的植株表现为:叶绿素含量显著减少、光合速率降低、生长迟缓,表明甘蓝型油菜BnHemd对叶绿素合成起重要作用,同时影响光合效率和生长发育。     

甘蓝型油菜CO 同源基因功能初步研究

CONSTANS（CO）基因是植物光周期途径中重要的转录调控因子。为了探究甘蓝型油菜CO 同源基因的 功能，以拟南芥CO 基因的CDS序列为参考序列，从甘蓝型油菜品种Westar的cDNA中分离得到CO 的两个同源基因 （基因编号：BnaC09g41990D 和BnaA10g18430D），命名为BnaC09CO 和BnaA10CO。构建双35S超表达载体转化哥 伦比亚拟南芥，得到超表达转基因株系，观察表型并进行定量分析。结果表明超表达转基因株系的开花时间比野 生型早3~5 d，BnaC09CO、BnaA10CO、FT 与SOC1 表达量较野生型显著升高。说明在长日照条件下甘蓝型油菜 BnaC09CO 和BnaA10CO 基因起到了与CO 基因类似的作用，能够引起拟南芥FT 和SOC1 的上调表达，从而促进拟南 芥的开花。     

甘蓝型油菜BnKNAT2基因克隆和功能分析

为分析甘蓝型油菜中调控分生组织细胞特异分化的KNOX基因家族成员KNAT2,从品种中双11号中分离克隆了BnKNAT2基因,ORF长984bp,由5个外显子组成,该基因编码327个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质包含有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN结构域,属I类KNOX蛋白。甘蓝型油菜中BnKNAT2存在4个拷贝,在主花序(原基)、授粉后7d的角果和茎中活跃表达。利用35S启动子构建了BnKNAT2的超表达载体(pD1301S-BnKNAT2)转化拟南芥野生型Col-0,21个转基因株系（T2）的叶片呈现不同程度卷曲、蜷缩以及波纹状叶缘。另外,BnKNAT2转基因株系开花期相比野生型明显推迟。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、葵花等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。本文还对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1:1、BnSAD2:1、BnSAD2:2和BnSAD2:3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP (C18:0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18:1-ACP)的过程,尤其是BnSAD2:3可能为种子特异表达基因。     

甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能及进化分析

在高等植物中,线粒体转录终止因子(mTERF)影响线粒体或叶绿体的基因表达及植物对逆境的反应等生物学过程。为了研究甘蓝型油菜中线粒体转录终止因子1(mTERF1)的功能,本研究以甘蓝型油菜品种中双11号为材料,在A06连锁群上克隆了mTERF1,该基因编码285个氨基酸,含有5个mTERF功能结构域。利用生物信息学分析筛选到37个甘蓝型油菜mTERF家族蛋白,并进行了系统进化树、基因结构及染色体定位分析。此外,构建甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能互补表达载体,转化拟南芥mTERF1(soldat10)突变体后,拟南芥的表型恢复到野生型(Ler),说明该基因在油菜和拟南芥中具有保守的功能。本研究填补了油菜中线粒体转录终止因子研究的空白,为进一步探究油菜中线粒体转录终止因子的分子功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

湘油15 PGIP9蛋白基因的克隆和蛋白序列结构分析及原核表达

运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测.结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9.N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点.N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基.二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲.中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成.随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET -32a(+)中,构建pET - 32a - PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2h,都成功的表达了融合蛋白pET - 32a - PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在.没有可溶形式的蛋白表达.     

生殖生长期源库改变对大豆籽粒产量和品质的影响

利用蛋白质，脂肪含量不同的两个大豆品种，在Ｒ１和Ｒ５期，通过去叶或去英，研究源库改变对大豆籽粒产量和品质的影响，结果表明，Ｒ１期和Ｒ５期去叶１／３对产量和品质影响不大；然而，Ｒ１期全去叶，减少了单株英数，产量降低，但对品质影响不明显；Ｒ５期全去叶，降低了每英粒数和百粒重，有利于蛋白质积累，而不利于脂肪积累，产量降低，Ｒ５期去英１／３增加了单英粒数和百粒重，产量略有提高，脂肪积累增多，蛋白质含量降低     

豫南旱地花生开花及干物质积累规律研究

通过对豫南旱地花生开花及干物质积累规律的研究,结果表明:豫南地区旱地花生苗期短,有效花期短,前期生长发育快,产量形成分配系数高。旱地花生出苗后25 d左右始花,花期45 d左右,花后20d进入盛花期,单株平均开花量为120.1朵,初花期结果数占总果数的26.5%,盛花期结果数占总结果数的73.5%,末期开的花为无效花。干物质积累出现苗期和开花下针期增长慢、结荚期增产快,饱果成熟期又下降的趋势,干物质积累的高峰出现在苗后68 d,日增重量达0.92 g/株。     

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。     

可可FAT基因家族进化及表达模式分析

在植物中,酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）是调控脂肪酸合成的关键酶。为解析可可FAT基因家族成员的特点与功能,本研究从可可基因组中筛选鉴定出FAT基因家族的6个成员,分别命名为TcFATA、TcFATB1、TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4、TcFATB5。6个基因外显子数目为6~7个,编码区（CDS）长度介于1128~1263 bp,预测蛋白分子量介于42.72~46.47 kDa,等电点介于6.57~9.10。进化分析结果表明可可FAT基因家族分成FATA与FATB亚群,FATA亚群包含1个可可TcFATA成员,FATB亚群包含5个可可TcFATBs成员。不同可可种子发育时期表达分析结果表明:TcFATA和TcFATB1伴随果实发育成熟,表达量呈下降趋势,TcFATA和TcFATB1在不同种质中表达量与油酸（C18:1）和棕榈酸（C16:0）比例呈正相关,表明其与脂肪酸组分比例调控有紧密关联。     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。