板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒/板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统.以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段.为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响,利用一段5.4 kb板栗疫病菌染色体DNA序列,构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒,分别转化板栗疫病菌EP155原生质体,检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率.结果表明,在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1 (1.7～2.0 kb)、FHA2 (1.0～1.2 kb)和FHA3 (0.5 kb)的同源重组频率分别为3.73% 、2.06%和0;3个同源单交换质粒pFH1 (1.76 kb)、pFH2 (1.23 kb)和pFH3(0.54 kb)的同源重组频率分别为0.95% 、0和0.这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据.     

板栗疫病菌低毒力遗传转化株LC的构建

低毒病毒—板栗疫病菌组合是研究病毒—宿主相互作用的模式系统之一。通过构建含板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA和苯菌灵抗性基因的表达质粒pXB3F2,并用于转化野生型无毒株EP155,获得了以苯菌灵抗性为筛选标记、具有dsRNA病毒再生能力的低毒力遗传转化株LC,为深入研究病毒—真核宿主相互作用的分子机制提供了新的研究材料。     

一种用于板栗疫病菌基因打靶系统的新型抗性筛选标记

板栗疫病菌是研究病原真菌的模式物种之一。目前应用于板栗疫病菌遗传转化的筛选标记有潮霉素、苯菌灵和G418抗性基因。随着板栗疫病菌致病分子机理研究的深入,需要更多的遗传筛选标记用于多重基因的遗传转化分析。本研究通过融合PCR技术,成功利用博莱霉素抗性基因Bleor进行了板栗疫病菌高丰度分泌表达基因的打靶实验,证实了Bleor作为板栗疫病菌基因筛选标记的可行性。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒／板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统。以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段。为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响，利用一段5．4kb板栗疫病菌染色体DNA序列，构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒，分别转化板栗疫病菌EPl55原生质体，检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率。结果表明，在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1（1．7～2.0kb）、FHA2（1.0～1.2kb）和FHA3（0.5kb）的同源重组频率分别为3．73％、2。06％和0；3个同源单交换质粒pFHl（1．76kb）、pFH2（1．23kb）和pFH3（O．54kb）的同源重组频率分别为0.95％、0和0。这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据。     

G418抗性筛选标记在板栗疫病菌中的应用

板栗疫病菌一低毒病毒系统．是一个优良的研究植物病原真菌致病和病毒一宿主相互作用分子机制的模型。随着研究的深入，原有的苯菌灵和潮霉素两个遗传转化筛选标记已不能满足研究需要。文章报道构建一个由构巢曲trpC启动子驱动的G418抗性Neo基因盒，并成功应用于板栗疫病菌的遗传转化研究。     

大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除

低毒病毒/板栗疫病菌是一个研究病毒宿主相互作用的优良的实验系统.为了更好的了解病毒与宿主相互作用的机制,我们建立了一个野生型无病毒板栗疫病菌菌株EP155和受低毒病毒感染的菌株EP713的cDNA混和文库,以进行表达序列标签（EST）测定.对543个克隆的外源片段的分析表明,该文库克隆中含外源片段的比例为89.8%;通过小规模测序,发现空质粒与小片段克隆占测序总数的10.1%;表达丰度最高的4个克隆出现次数的总和占测序总数的9.6%.通过设计引物进行PCR和原位杂交,对cDNA文库2万多个克隆进行了筛选,共筛除了占总数19.7%的空质粒与小克隆和5.5%的高丰度克隆,为高效率的大规模EST测序准备了条件.     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化

绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键.本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272.采用LipofectamineTM (Lip)2000介导线性化质粒p EGFP-loxp-Lox22 72转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μL Lip 2000转染细胞的效果最理想;转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞.本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考.     

用猪骨髓间充质干细胞为供体生产猪的转基因胚胎

以pEGFP-N 1质粒,通过电转染的方法转染了猪骨髓间充质干细胞,经过G 418筛选,获得了阳性细胞克隆。以转染的猪骨髓间充质干细胞与体外成熟(in v itro m aturation,IVM)的卵母细胞构建克隆胚。结果表明:通过体细胞核移植技术,猪骨髓间充质干细胞可以有效地生产转基因囊胚,并且绿色荧光蛋白可用于转基因胚胎的筛选。     

应用双分子荧光互补(BiFC)方法分析烟草中介体亚基之间的互作

中介体是一种大分子蛋白复合物,中介体亚基之间的相互作用是中介体复合物在真核生物的转录调控中发挥作用的基础。本研究利用同源搜索,克隆了烟草(Nicotiana tabacum)中介体亚基基因NtMed6、NtMed18和NtMed21,测序结果表明NtMed6、NtMed18和NtMed21与拟南芥(Arabidopsisthaliana)中介体同源基因的序列一致性分别为69.46%、76.91%和77.01%。通过筛选适宜的侵染培养基优化了农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达进行亚细胞定位方法,分析了linker序列对亚细胞定位结果的影响。发现以YEB+100mmol/LAS和AA+100mmol/LAS为侵染培养基时荧光强度大,并且表达荧光的细胞多;构建融合表达载体时添加5个氨基酸编码序列的linker提高了融合蛋白亚细胞定位结果的可靠性。烟草中介体亚基亚细胞定位表明,NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21定位在细胞核和细胞质内,但主要在细胞核里。为进一步证实NtMed8属于烟草中介体亚基,同时研究NtMed8与其它亚基的相互作用,构建了35S驱动的含有EYFPN-端1-173氨基酸和C-端151-238氨基酸编码序列标签的融合表达载体(pNYE和pCYE)。把NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21的全长ORF亚克隆到相应的载体上,共转化烟草(Nicotiana benthamiana)叶片,结果表明,NtMed8与NtMed18存在互作,同时还观察到NtMed8与NtMed6的互作以及NtMed18与NtMed6的互作。BiFC用于检测蛋白之间的互作是一种快捷有效的方法,能够应用于中介体亚基之间结构联系的研究。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2,全基因组序列测定结果表明,JX-2DNA．A全长2738个核苷酸,共编码6个开放阅读框架（openreadingframes,ORFs）,其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明,JX-2DNA—A与中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV）各分离物的相似性在93．0％-99．7％之间,其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV．G32的相似性最高,达99．7％,而与其它双生病毒的同源性均在88．0％以下,表明Jx-2是ToLCCNV的一个分离物。基于Jx-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示,JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近,并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支,而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01／β02在Jx-2样品中扩增到DNAβ分子（JX-2β）,全长为1341个核苷酸,其互补链编码1个ORF（即βC1）,并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明,JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91．0％～96．1％之间,其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV—G18DNAβ的相似性最高（96．1％）,与其它卫星DNAβ的相似性均低于61．8％。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示,JX-29与ToLCCNVG61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。     

施氮量对超高产小麦开花期旗叶光合功能的影响

在田间条件下,采用开放式气路测定了小麦旗叶的光合功能的相关指标,研究了施氮量对超高产小麦旗叶开花期荧光动力学参数的影响。结果表明,氮素对超高产小麦开花期的荧光动力学参数和光合特性有较大的调节作用。随着光照时间的延长,小麦旗叶的荧光参数ΦPSII（作用光存在时PSII实际的光化学量子效率）、qP（光化学猝灭系数）、F’v/F’m（开放的PSII反应中心的激发能捕获效率）、NPQ（非光化学猝灭系数）、ETR（电子传递速率）逐渐上升并在20 min左右趋于稳定,与光合同步;但在高氮条件下ΦPSII和qP反而较低氮处理的降低。表明在合理的施氮范围内,施氮能通过提高F’v/F’m、NPQ、ETR来增强光合机构对环境的适应能力,进而保护光合器官。在本试验条件下,超高产麦田的适宜施氮量为N 300 kg/hm2。     

白洋淀沉积物中溶解有机质荧光特性及其与铜的相互作用

在实验条件下通过三维荧光光谱、荧光猝灭滴定和质子核磁共振（1HNMR）,分析了白洋淀污染水体沉积物中溶解有机质（DOM）与Cu（Ⅱ）的相互作用。结果表明：DOM的结构以碳水化合物及多糖为主且具有明显的类蛋白（峰B）和类富里酸（峰A和峰C）荧光峰,类蛋白的荧光强度较强于可见类富里酸;3类荧光基团荧光强度由于Cu（Ⅱ）猝灭,呈明显不同程度的降低;并且DOM与Cu（Ⅱ）络合常数及1HNMR分析表明DOM中荧光基因与Cu（Ⅱ）络合或螯合能力较大,配位的配位基较多。