猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。     

山东某猪场繁殖障碍性疾病的诊断研究

采用ELISA、PCR、RT-PCR及细胞培养等方法对山东某猪场流产、死胎及出生后几天死亡的小猪进行猪瘟病毒(CSFV),伪狂犬病毒(PRV),圆环病毒2型(PCV-2),细小病毒(PPV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)五种繁殖障碍性疾病进行检测,并应用ELISA猪瘟抗原检测试剂盒检测猪瘟病毒.检测结果表明,猪瘟病毒与圆环病毒2型为阳性,猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒均为阴性.根据结果判定该猪场发生猪瘟病毒与圆环病毒2型混合感染的繁殖障碍性疾病,其中以猪瘟感染最为严重.     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒河南株的分离鉴定

【研究目的】为了研究猪圆环病毒的分子生物学特征及其发病机理和致病机制,【研究方法】将疑似猪圆环病毒2型的猪脾脏、淋巴结用胰蛋白酶消化处理后接种PK-15细胞,盲传6代后,病毒已经适应PK-15细胞,【研究结果】然后设计一对特异性引物利用PCR技术扩增出ORF2片段中540 bp的基因。第6代细胞病毒液经间接免疫荧光检测表明,在荧光显微镜下可见PCV特征的荧光斑,表明毒株具有感染性。【结论】将病毒纯化后进行电镜观察,病毒粒子直径约17nm,圆形,无囊膜,研究结果表明分离的病毒为猪圆环病毒。     

猪瘟病毒河南野毒株E2基因的克隆及序列分析

【研究目的】旨在了解猪瘟病毒流行毒株的变异情况,为防制猪瘟提供科学依据。【方法】根据GenBank上已发表的猪瘟石门株E2基因序列,设计合成了1对特异引物,应用RT-PCR技术对河南省一猪场采集的疑是猪瘟病料的猪瘟野毒E2基因进行扩增,将扩增的E2基因克隆于pGEM-T Easy载体,对其进行了序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与HCLV株、C株、Alfort株和Brecsia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树。【结果】通过PCR扩增得到与预期大小相等的产物,克隆测序验证是E2基因;所扩增的流行野毒与HCLV株、C株、Shimen株、Alfort株和Brecsia株核苷酸序列同源性分别为99.0%,96.5%,93.5%,94.4%和89.9%;氨基酸同源性分别97.8%,94.0%,92.6%,92.0% 和91.0%;所绘制的遗传发生树显示所测得流行野毒与C株、HCLV株关系较近。【结论】所测的流行株与与我国使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高,说明现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。     

猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

非洲猪瘟病毒LNA引物PCR检测方法的建立及优化

为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×10¹ copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

喷施硫酸钴对紫花苜蓿鲜草产量及品质的影响

采用叶面喷施的方法,研究了不同施钴水平对紫花苜蓿鲜草产量和营养品质的影响。结果表明：喷施硫酸钴显著（P＜0.05）提高了苜蓿鲜草产量,其中施钴量为300 mg/kg的处理效果最好,比对照CK产量可以提高25%。同时显著能够提高苜蓿叶茎比。不同施钴水平对苜蓿营养成分的含量影响不同,苜蓿粗蛋白及磷含量随随钴量的增加而增加,而对苜蓿粗纤维、粗灰分和无氮浸出物含量没有显著的影响,粗脂肪则随着施钴量的增加而逐渐降低。不同施钴水平对紫花苜蓿营养物质产量影响不同,其中粗蛋白、粗灰分、磷和无氮浸出物产量均以Co2处理300 mg/kg最高,都要显著高于对照,粗纤维、钙产量也以Co2处理最高,但与CK没有显著差异,粗脂肪产量则以Co1处理100 mg/kg效果最好     

留茬高度与刈割时株高对墨西哥玉米产量及饲用品质的影响

在大田条件下，比较了不同留茬高度和刈割时株高对墨西哥玉米（Euchlaena mexicana）产量和饲用营养品质的影响，采用概略养分分析法评价其饲用价值。结果表明，留茬30 cm处理的总鲜草产量为14.1 kg·m^-2，总干草产量为1.90 kg·m^-2，显著高于留茬20 cm和留茬10 cm处理；其粗蛋白（CP）和粗纤维（CF）含量较高，粗灰分（CA）和无氮浸出物（NFE）含量较低。株高130 cm时刈割与对照处理（株高95 cm）的产量差异不显著，但其CP、NFE含量较低，CA和CF含量较高；株高60 cm刈割处理的CP、NFE含量高，CA和CF含量低，但产量显著低于对照处理。综合分析5项饲用营养成分和总能量（GE）产量，留茬高度30 cm、株高95 cm时刈割可实现墨西哥玉米生产的高产优质。     

种植密度对不同类型玉米青贮产量和营养价值的影响

为明确不同类型青贮玉米在临沂地区最佳种植密度,设置了4个密度梯度（60 000、75 000、90 000、105 000株/hm ²）,研究种植密度对专用型青贮玉米雅玉8号和粮饲兼用型玉米登海605饲用产量和营养价值的影响。结果表明：密度对不同类型青贮玉米鲜草、干草产量影响显著,密度增加,青贮玉米鲜草产量和干草产量均先增加后减少,在密度75 000株/hm ²时均获得最高鲜草、干草产量。密度对不同类型青贮玉米粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维含量和子粒产量、粗蛋白产量、粗脂肪产量、可消化干物质、相对饲喂价值、无氮浸出物含量和总能量影响显著,密度增加,雅玉8号粗蛋白、粗脂肪含量和可消化干物质、干物质采食量、相对饲喂价值和无氮浸出物含量下降,粗灰分、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量呈上升趋势,子粒产量、粗蛋白、粗脂肪产量和总能量先增加后减少,在密度75 000株/hm ²均获得最高子粒、粗蛋白、粗脂肪产量。从饲料总能量来说,专用型青贮玉米雅玉8号和粮饲兼用型玉米登海605在山东临沂地区饲用的最佳种植密度均为75 000株/hm ²。     

多花黑麦草在生长兔上的营养价值评定

为评定多花黑麦草在生长兔上的营养价值,研究以福建黄兔为对象,对2 个多花黑麦草品种采用全粪收集法进行消化试验。结果表明：福建黄兔生长兔对多花黑麦草‘美克斯’和‘海里克斯’干物质（DM）、粗蛋白质（CP）、粗纤维（CF）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、粗脂肪（EE）、粗灰分（ash）、钙（Ca）、磷（P）和无氮浸出物（NFE）的表观消化率分别为：52.67%、82.68%、21.70%、26.58%、28.59%、68.37%、57.69%、71.64%、70.82%、64.38%和50.45%、79.53%、24.69%、30.45%、32.69%、69.84%、59.38%、70.48%、69.31%、69.30%。其中生长兔对多花黑麦草DM、CP、EE、Ca 和P 的表观消化率较高,对CF的表观消化率较低。     

新型饲草玉米生长动态及收割期的研究

对新型饲草玉米不同生长阶段的生长速度、物质积累与分配进行了研究,并对其营养价值进行评定。结果表明,新型饲草玉米生长动态符合Logistic模型,经历了慢—快—慢—快—慢的变化过程;从分蘖期至吐丝期,生物量和茎/叶比值增加,但适口性和营养价值降低,抽雄期后降低更为迅速;其中总能（GE）、消化能（DE）、代谢能（ME）和可消化养分总量（TDN）在孕穗期或抽雄始期最高;抽雄始期鲜草产量和干物质产量分别达101.4 t hm^-2和18.35 t hm^-2,粗蛋白（CP）、粗纤维（CF）、粗脂肪（EE）、粗灰分（CA）和无氮浸出物（NFE）含量分别为14.2%、24.3%、3.9%、6.3%和51.3%,产草量和营养价值均较高。综合分析表明,为同时获得较高物质产量和营养价值,饲草玉米在抽雄始期收割最佳。     

春箭筈豌豆生长动态及收割期的研究

为了研究春箭筈豌豆的生长发育和营养变化动态规律,了解其最佳刈割期,以春箭筈豌豆5-1-5品系为材料,研究了春箭筈豌豆株高、生长速度、物质积累、产量组成及其构成因子的变化规律,并对其营养价值进行了评定。结果表明,春箭筈豌豆生长动态符合Logistic 模型,苗期生长缓慢,分枝后期-现蕾期生长最快,是营养体产量形成的关键时期;生物量和茎/叶比值,从分枝后期开始逐渐增加,但适口性和营养价值降低;鲜草和干草产量分别在结荚期和成熟后期达到高峰,结荚期鲜草产量、CP、CA、CF、EE、NFE、TDN产量分别为17.2、0.5、0.33、1.29、0.11、2.17、2.73 t/hm2;成熟后期干草产量、CP、CA、CF、EE、NFE、TDN产量分别为4.71、0.41、0.34、1.40、0.10、2.49、2.83 t/hm2。综合分析认为,播种后76~88 天左右是春箭筈豌豆的最佳刈割期。在饲草实际生产中,春箭筈豌豆应在开花至结荚初期进行收割。     

优良牧草与花生间作套种的探讨

首次在河南省对5种优良牧草和花生进行间作套种的研究,并且在牧草与花生“5+6”套作模式的情况下,对比与分析了两者的相互影响、综合生产水平以及可行性。研究表明,套种后紫花苜蓿、白三叶以及苇状羊茅影响花生果实产量,花生果实产量分别下降14.2%、12.6%和7.6%,达到了极显著(前两者)和显著水平。苜蓿和白三叶还对花生的百果重、饱果数有抑制作用,而对总果数影响不大。和紫花苜蓿套作,花生秧产量下降7.3%(p<0.05),与其他牧草套作花生秧的产量无显著影响。与花生的套作能够极显著地促进多年生黑麦草、鸡脚草和苇状羊茅3种禾草的分蘖(11.01%~14.26%)(p<0.01),显著增加其叶面积指数(4.62%~6.37%)和叶绿素含量(5.04%~5.50%)(p<0.05),3种禾草的青干草产量分别提高了8.2%、8.1%、9.3%。花生秧与禾草混合调制成青干草后,饲草中的粗蛋白、粗脂肪和钙的含量得到了显著和极显著的提高,而粗纤维含量却明显降低。与花生套作能够提高紫苜蓿产草量5.8%(p<0.01)和,但豆科牧草与花生秧混合调制以后,粗蛋白、粗纤维以及钙和磷的含量明显下降,粗脂肪得到了极显著的提高。     

不同类型饲用作物营养成分的比较研究

对3种类型饲用作物杂交苏丹草皖草2号、墨西哥玉米和粮饲兼用玉米农大108进行了比较。结果表明,鲜、干物质产量以皖草2号最高,墨西哥玉米其次,农大108最低。皖草2号和墨西哥玉米叶片是干物质产量构成的主体,对农大108茎秆是主体。皖草2号粗蛋白(CP)、无氮浸出物(NFE)、酸性洗涤纤维(AWF)、粗脂肪(EE)、粗灰分(CA) 5大养分产量均显著高于墨西哥玉米和农大108,其粗蛋白和粗灰分含量均低于墨西哥玉米高于农大108。皖草2号总能量(GE)极显著高于墨西哥玉米和农大108,分别高出1 448.024×10⁶ J·hm^-2和2 339.687×10⁶ J·hm^-2。农大108干物质和粗蛋白降解率最高,分别为57.880%和12.424%。墨西哥玉米粗纤维的降解率显著高于皖草2号,但它们的干物质和粗蛋白降解率差异不显著。3种类型饲用作物营养价值差异来自其生物学特性的显著差异。     

西藏林芝地区陇东苜蓿不同生育期养分动态研究

本文研究了陇东紫花苜蓿不同生育期营养物质的变化情况,测定结果表明,紫花苜蓿在返青初期干物质的含水量、粗脂肪(EE)和粗灰分含量最高,分别为89.45%和6.42%,15.47%;枯黄期粗纤维(CF)含量最高,达44.92%;返青一个月的粗蛋白（CP）含量最高,达25.33%。随着生育时间的推移,水分,粗灰分（ash）和粗蛋白(CP),粗脂肪(EE)含量呈逐渐下降趋势,而粗纤维(CF)含量呈升高趋势。紫花苜蓿的营养价值和饲用品质随着机体成熟度的增加而显著降低,返青初期的品质优良,分枝期的品质良好,结实期的品质差,枯黄期对家畜基本无饲用价值。     

谷子干草饲用品质性状变异及相关性分析

谷子是重要的饲草作物, 但其饲草品质性状研究滞后制约了谷子饲草品种培育和栽培。本研究对47个谷子品种在我国高寒农牧地区栽培的饲用干草品质性状进行了系统测定。结果表明, 供试材料粗蛋白含量的变异范围为5.42%~12.45%, 变异系数为14.25;粗脂肪含量的变异范围为0.64%~1.43%, 变异系数为15.84;粗灰分含量的变异范围为8.50%~15.60%, 变异系数为13.71;总磷含量的变异范围为0.10%~0.32%, 变异系数为20.00;总钙含量的变异范围为0.27%~0.67%, 变异系数为20.00。粗纤维、无氮浸出物和水分含量表现出较小的变异。主成分分析表明, 影响谷子饲草品质的主要性状是粗纤维、粗灰分、粗蛋白和无氮浸出物, 粗蛋白与粗纤维和无氮浸出物均为负相关。综合表明, Li05-569、饿死驴、系295和红根谷是品质性状综合表现优良的品种。