单增李斯特菌单克隆抗体制备及免疫磁珠分离方法的建立

免疫磁珠技术操作简单、快速高效，目前已广泛应用于细菌的快速分离纯化等领域，本研究旨在建立一种捕获率高、特异性好的单增李斯特菌免疫磁珠分离方法。首先通过杂交瘤技术制备出8株抗单增李斯特菌单克隆抗体，效价均达到1∶1 024 000,且特异性较好。利用效价最高的腹水6-E6制备单增李斯特菌免疫磁珠，并对单增李斯特菌免疫磁珠最适条件进行优化，结果选择MEST(7.0)为偶联缓冲液、磁珠直径为750 nm、免疫磁珠添加量为0.4 mg、捕获时间45 min、单增李斯特菌含量在1×10⁴ CFU/mL时，免疫磁珠捕获率最高可达76.29%。在模拟牛奶样品中免疫磁珠特异性捕获率可达到67.71%。该分离方法可快速且特异地分离单增李斯特菌，操作简便，为快速分离食品中的单增李斯特菌并实现快速检测提供了技术支持。     

黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素的作用

为了研究黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素(LLO)溶血活性及单增李斯特菌致病力的影响,试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、分析溶血活性、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性试验的方法分析了黄芩提取物对单增李斯特菌增殖、单增李斯特菌溶血素溶血活性和单增李斯特菌对细胞的毒性作用。结果表明:黄芩提取物可通过直接中和单增李斯特菌溶血素活性而降低溶血活性,且这一作用与黄芩提取物的抗菌活性无关;在细菌与细胞共培养体系内加入黄芩提取物可有效抑制细菌对细胞介导的细胞毒性作用。说明黄芩提取物是一种潜在的抗单增李斯特菌感染的先导化合物。     

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。     

使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。     

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种世界范围内的食源性病原菌,食用被该菌污染的食物会引起李斯特菌病,致死率高达20％～30％.单增李斯特菌广泛存在于环境、食品、人和动物宿主中,可以在极端条件下生存并引起食物污染,已成为人们关注的重要公共卫生问题.论文主要综述了近年来国内外几种关于单增李斯特菌的快速检测方法,包...     

单增李斯特氏菌检验

本研究对肉、胴体拭子等400份单增李斯特氏菌样品进行前增菌,然后用荧光PCR方法对前增菌样品进行检测,挑取阳性样品进行后续的分离、鉴定.结果显示,本研究在传统单增李斯特氏菌分离、鉴定方法基础上增加了荧光PCR初步筛选,提高了检测的灵敏度与特异性,省工省时,最终分离到5株单增李斯特氏菌.     

肉类及其制品中单增李斯特氏菌的控制方法

单增李斯特氏菌在自然界广泛分布,是一种能感染人类的致死率较高的食源性致病菌。肉制品的保存关键问题之一是解决单增李斯特氏菌的生长,研究开发高效、低毒并对单增李斯特氏菌有明显抑制作用的新型防腐剂显得尤为重要。本研究从天然香料、化学抑制和微生物抗菌三个方面介绍控制单增李斯特氏菌的方法。     

单增李斯特菌在乳粉中的生存特性

单增李斯特菌是乳粉中常见的致病菌之一。为了解不同水活性（Aw）干乳粉、复水乳粉和热冲调乳粉中单增李斯特菌的生存特性，通过人工方法将单增李斯特菌添加于不同Aw的干奶粉、复水奶粉中，并在不同温度或pH条件下培养，通过菌落计数来分析单增李斯特菌的生存特性。结果显示：在4 ℃条件下，单增李斯特菌可在较低Aw（0.81、0.92）的干奶粉中长期保持生长活力，并且当Aw较高（0.96）时，会有增长趋势；在25 ℃条件下，干奶粉中的单增李斯特菌的生长活力很快减退，细菌处于亚损伤状态。复水奶粉中的单增李斯特菌能够生长的温度为-1.5~37 ℃，在pH4.4~8.0的复水奶粉中，高温条件下（30 ℃）比在低温条件下（4 ℃）生长快，但在低温条件下，对酸碱的耐受程度比在高温条件下大。单增李斯特菌在复水的高糖高脂奶粉中比原料奶粉中对热的耐受力强。结果表明，高温条件更易使干奶粉中单增李斯特菌生长活力减退，复水奶粉如果污染单增李斯特菌，在低温条件下贮存则能够控制单增李斯特菌的生长，高糖高脂成分可提高单增李斯特菌的热抵制能力。本研究为乳粉中单增李斯特菌的风险评估和关键控制措施的制定提供了依据。     

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究

为建立一种快速、便捷的单增李斯特菌检测方法,本研究针对单增李斯特菌hlyA基因设计了4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的探针,采用环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸条检测技术(LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的单增李斯特菌LAMP-LFD检测方法。通过对其反应条件进行优化,结果显示,优化后的扩增温度和时间为63℃反应50 min,完成检测全过程仅需80 min。该方法仅可以特异性地检出单增李斯特菌,而对其它6种常见食源性致病菌的检测均呈阴性。对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.6 cfu/m L,是利用外引物建立的PCR方法的100倍。该方法重复性好。对15份牛奶和15份猪肉的细菌分离鉴定和LAMP-LFD检测表明,二者符合率为100%。研究结果表明,本研究建立的LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测单增李斯特菌,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值。