拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

Pbf启动子在小麦离体胚乳中的特性分析

为了探明胚乳特异启动子的调控活性，对小麦醇溶蛋白盒结合因子基因（pbf）的启动子序列进行了5´、3´和中间缺失片段-GUS基因嵌合体载体（pbf.a-d）的构建，并在小麦离体胚乳中转化。GUS瞬间表达活性检测和功能缺失试验表明：pbf 的-2510- -1bp全长序列能够在小麦离体胚乳中表现活性，而5´ 端-2510bp- -670bp以及3´端-1288bp- -1bp序列的缺失则使启动子在胚乳中丧失了活性；中间序列-2160bp- -689bp的缺失使GUS的表达强度明显降低。文中对pbf启动子序列中存在的重要基序种类和数量以及基序对启动子表达调控活性的作用也给予了初步分析。本文对小麦胚乳发育状态及GUS瞬间表达体系等对pbf启动子活性检测的影响也作了探讨。     

小麦-黑麦1BL/1RS易位系7-1抗纹枯病的分子细胞学鉴定

黑麦(Secale cereale)是小麦(Triticum aestivum)的重要三级基因源,具有小麦改良所需要的多种优良性状。为丰富小麦杂交育种新的种质资源,利用墨西哥黑麦(2n=2x=14,RR)与普通优质小麦W770B(2n=6x=42,AABBDD)杂交,经过多年筛选,选出若干优良性状的衍生系,在小麦五叶期时用PDA培养基培养的带纹枯病菌的牙签,接菌到小麦芽鞘内,温室内培养,5周后鉴定纹枯病发病等级,计算病情指数,为了结果的准确性,经过多次牙签法鉴定,筛选出病情指数为PI=32.8%的抗病衍生系7-1。为明确衍生系7-1的遗传成分,本研究综合采用形态学、细胞遗传学、基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)、特异序列扩增(sequence characterized amplified region,SCAR)分子标记、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记和醇溶蛋白分析。对7-1的根尖细胞和花粉母细胞的细胞遗传学观察表明7-1染色体结构和数目稳定2n=42=21Ⅸ;以黑麦DNA为探针的GISH分析观察表明7-1含有两个黑麦染色体臂;黑麦基因组SCAR标记分析表明,D15和P13LF/R能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦特异条带,黑麦1RS SCAR标记分析表明,ω-sec-p1/ω-sec-p2、ω-sec-p3/ω-sec-p4和IB-267能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦目的条带,说明7-1具有黑麦1RS染色体;筛选小麦每条染色体长短臂上的多对引物,在7-1中只有1BS上的引物Xgwm264和Xgwm11未能扩增出相应条带,其余染色体上的引物均扩增出了条带,说明7-1中缺失了小麦1BS染色体;醇溶蛋白分析表明7-1中扩增出了1RS黑麦碱条带,由此证实了小麦染色体1BS被黑麦染色体1RS所替换,该材料为小麦-黑麦1BL/1RS易位系。本研究中7-1为抗纹枯病的1BL/1RS易位系,为小麦纹枯病抗病育种提供了新的种质资源,拓宽了小麦育种材料。     

水稻HTD1基因启动子在转基因拟南芥中的表达特征

通过分析β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS）基因产物,对水稻HIGH-TILLERING DWARF1(HTD1)基因启动子在转基因拟南芥中的表达特性进行初步研究。用已构建的含HTD1基因启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,观察该启动子的表达特性。结果表明,在HTD1基因启动子的驱动下,GUS报告基因主要在转基因拟南芥幼苗期的叶片、叶柄、下胚轴以及主根基部的维管组织中表达。     

棉花Bax inhibitor-1基因启动子的克隆及初步验证

为研究克隆自陆地棉的GhBI-1A和GhBI-1B基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的分子机制,利用BD GenomeWalkerTM Universal Kit的染色体步移技术得到了2个棉花GhBI-1A和GhBF1B基因5’端上游的启动子序列,长度分别为1650bp和2001bp.生物信息学分析表明,GhBI-1A和GhBI-1B的启动子序列均存在TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,GhBI-1B启动子中还含有真菌诱导应答元件.以表达载体pBI101为基础,用所克隆的2个棉花GhBI-1基因启动子序列与GUS报告基因融合,构建新的植物表达载体并转入农杆菌.用叶盘法侵染烟草进行瞬时表达,结果表明2个启动子均能够驱动报告基因的表达.     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究

为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。     

马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析

叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。     

小麦3-磷酸-甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)上游序列的克隆及功能验证

3-磷酸-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)广泛地存在于各种生物体内,是生物体内糖异生和糖酵解过程中的关键酶。为了获取长武134小麦(TriticumaestivumL.)GAPDH上游序列并分析其启动子活性,本研究根据小麦GAPDH基因(GenBank登录号:EF592180.1)5'端序列设计特异引物,利用基因组步移法获得了该基因上游1071bp的序列;对该序列进行结构分析表明,转录起始位点可能位于起始密码子上游约700bp处;PlantCARE预测瞬时作用元件表明,在翻译起始密码子ATG的上游含有启动子基本结构元件TATA-box、CAAT框,以及能够应答脱落酸(abscisic acid,ABA)、干旱、低温等非生物胁迫逆境因子的多种顺式作用元件(如MYB、MYC、WRKY、ABRE、HSE和GT-1等);然后用GAPDH基因启动子序列替换植物表达载体pBI121GUS基因前的CaMV35S启动子,并构建启动子融合表达载体,并通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105介导转化烟草(Nicotianatabacum)叶盘进行了瞬时表达分析,以GUS作为报告基因研究在ABA、干旱、低温3种非生物胁迫下启动子的活性。结果显示,ABA、低温和干旱对启动子有较明显的诱导效应,其中以干旱诱导最为显著。本研究通过基因组步移克隆得到GAPDH基因的启动子,分析表明此启动子为有着强启动活性的诱导型启动子。     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

向日葵种子特异性启动子Ha ds10G1的克隆及其功能验证

利用PCR技术从向日葵基因组DNA中克隆了Lea蛋白基因家族中Ha ds10 G1基因上游1414bp的调控序列，序列分析表明-1—1414bp与报道序列同源性为100%，将其与GUS基因融合构建植物表达载体后，通过农杆菌介导法转化烟草NC89，PCR扩增初步证明目的片段已整合到烟草基因组中，转基因植株的GUS活性检测表明，在茎、叶中无GUS活性，GUS活性只存在于种子中，因此，Ha ds10 G1启动子具有种子特异性的功能。     

水稻AP2/ERF转录因子基因OsERF096启动子克隆及活性分析

提高水稻耐冷性对保障水稻高产、稳产具有重要意义。AP2/ERF转录因子能够抵抗外界逆境胁迫,课题组前期研究发现水稻OsERF096基因显著受冷胁迫诱导表达。本研究克隆了OsERF096启动子序列(-1~-1215 bp),通过软件预测发现OsERF096启动子中含有多个与低温及激素响应相关的顺式作用元件。根据元件分布特征进行了5′端片段缺失设计,构建了GUS表达载体P_(OsERF096-1215)-GUS、P_(OsERF096-1102)-GUS、P_(OsERF096-827)-GUS、P_(OsERF096-501)-GUS,并转化拟南芥。通过GUS染色和GUS基因qRT-PCR检测发现,正常生长条件下,4个不同长度的启动子中P_(OsERF096-1215)启动子活性最高,P_(OsERF096-1102)最低。与前期qRT-PCR检测不同,冷处理下OsERF096启动子活性未发生显著变化。这些结果为后续OsERF096基因的表达调控及生物学功能研究奠定重要基础。     

粤油7号花生AhNCED1基因启动子克隆及其活性分析

AhNCED1是干旱胁迫下花生中调控脱落酸（abscisic acid,ABA）生物合成的关键基因。本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗旱性强的粤油7号花生中克隆AhNCED1基因起始密码子ATG上游2392bp启动子序列,构建该启动子驱动报告基因GUS的植物双元表达载体pAhNCED1p∷GUS,转化野生型拟...     

pOsHistone3启动子在烟草中的表达特性分析

启动子在基因表达调控中发挥重要作用,分析启动子表达特性对于基因功能研究和启动子的开发利用有重要意义。本研究克隆了水稻组蛋白基因OsHistone3的启动子pOsHistone3,在PlantCARE中分析显示包含脱落酸、茉莉酸甲酯等生长调节剂信号应答元件和胚乳、茎尖、分生组织等部位特异表达元件。进一步构建启动子分析载体并对烟草作遗传转化,GUS染色分析显示,pOsHistone3在转基因烟草幼嫩组织如茎尖、嫩叶中GUS活性较高,而在成熟组织中仅在维管组织周围检测到GUS活性,说明pOsHistone3具有组织表达特异性。这些结果初步表明OsHistone3基因作为表观遗传调控的一个重要基因,可能在转录水平参与了植物生长调节剂信号和植株发育调控的过程。     

小麦TaDEP1基因启动子区转录增强序列的鉴定

RNAi干涉小麦TaDEP1基因导致小穗密度下降以及小穗数减少,表明该基因转录水平的降低会引起基因功能的丧失。为挖掘影响TaDEP1转录水平的作用元件,通过特异扩增D组TaDEP1基因启动子并进行测序,发现不同品种间存在132 bp序列差异,该序列位于TaDEP1基因起始密码子上游1 529~1 660 bp处。利用小麦微核心种质材料,鉴定到132 bp序列与TaDEP1基因的转录水平呈正相关,即启动子序列中含有132 bp序列的TaDEP1基因转录水平明显高于不含该序列的转录水平。启动子顺式作用元件分析结果显示,该132 bp序列未包含特殊的顺式作用元件。结合荧光素酶(LUC)活性试验,在小麦原生质体中证明该序列能够显著提高LUC的转录活性,表明该序列可作为小麦基因转录增强序列。本研究鉴定到新的小麦基因转录增强序列,为小麦分子标记辅助选择育种提供了基因资源与技术支持。     

黑麦属优异基因在小麦改良中的研究与应用

黑麦属(Secale cereale,2n=14,染色体组R)作为小麦的三级基因源,在小麦遗传改良中发挥了重要的作用。本文综述了黑麦属优异基因在普通小麦遗传改良中的应用及分子特性的最新研究进展;并将报道的黑麦相关基因及数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)整合到其物理图谱,发现在1R染色体上分布的优异基因最多,从而在分子水平上解释了1RS/1BL易位系得以广泛应用的原因;并对黑麦属优异基因的进一步利用进行展望。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视。本研究以pCAM-BIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体。通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用。组织化学检测结果表明：CaMV35S启动子调控下的iGUS（带内含子）基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子（带内含子）调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子（带内含子）驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生。Ubi1启动子（带内含子）调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用。本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义。     

玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。     

水稻铵转运蛋白基因OsAMT1;2的启动子分析

AMT是介导植物铵态氮高亲和吸收的跨膜蛋白,已报道编码AMT蛋白的大部分基因的表达依赖外界氮水平和环境的调控,但调控的机制目前尚不清楚。水稻的Os AMT1;2基因在氮缺乏条件下强烈诱导表达,因此,本研究从水稻基因组DNA中PCR克隆Os AMT1;2基因上游1 940 bp的启动子序列,采用软件和试验分析Os AMT1;2启动子存在的顺式调控元件与外界氮调控的相关性。软件预测结果表明,启动子区域内除含有TATA-box和CAAT-box外,同时含有多种非生物胁迫、生物胁迫、激素响应和光响应相关的顺式作用元件,如Box-w1、MBS、Me JA、TATC和ERE应答元件。将Os AMT1;2启动子的5′端顺序删除获得5个不同缺失片段分别与GUS报告基因融合构成表达载体,通过农杆菌介导转入水稻成熟胚诱导的愈伤组织中获得转基因水稻,T1代植株水平上的GUS活性分析表明,最短启动子片段(–211 bp)能够启动GUS表达,但是GUS活性较低,对缺氮效应也不显著;中等长度启动子片段(–763 bp)的GUS活性提高,受缺氮诱导显著,且缺氮诱导不再随启动子长度增加而显著增强,说明应答氮响应的顺式作用元件位于–211 bp和–763 bp之间,非生物胁迫和激素相关的顺式作用元件多在这个区域内,是否与氮的调控存在相关性有待后续进一步证明。