广东兰花病毒病调查和病原检测

本试验主要是采用症状观察和ELISA方法榆测兰仡病毒。检测材料是从广州兰圃、芳村兰场、华南植物园、深圳苗圃场采集的兰花标本。兰花病株症状类型有花叶、黑褐色坏死斑或斑块：有的叶片在褪绿处变薄，后变灰、干缩、破裂成丝。ELISA检测结果表明墨兰、文心兰、大花惠兰(组培苗)、蝴蝶兰、万代兰和卡特兰等几个品种共22个样本含有病毒，其中含有建兰花叶病毒(CyMV)的有10个品种，含有齿兰环斑病毒(ORSV)的有7个品种，民时含有两种以上病毒的有3个品种6个样本。     

二温式多重RT-PCR同删两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,建立了二温式多重RT-PCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增,结果同时得到2条大小与实验设计相符的769bp(Cy MV)、1000bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测,结果11个样品检测出Cy MV,阳性率28.2%;24个样品检测出ORSV,阳性率61.5%;6个样品同时检测出两种病毒。     

二温式多重RT-PCR同时检测两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物，建立了二温式多重RTPCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增，结果同时得到2条大小与实验设计相符的769 bp(CyMV)、1 000 bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测，结果11个样品检测出CyMV，阳性率28.2%；24个样品检测出ORSV，阳性率61.5%； 6个样品同时检测出两种病毒。     

实时荧光RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CymMV）是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。     

文心兰病毒病病原鉴定

在云南省昆明市的文心兰栽培基地发现了具有病毒病典型症状的感病文心兰植株。感病样品在电镜下可观察到长460-500 nm的线状病毒粒体和长约300 nm的杆状病毒粒体中的一种或两种,分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。感病样品可以和建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒血清中的一种或两种呈阳性反应。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物,运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明,云南文心兰病毒病的病原是建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种。     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

’99世博会日本菊花检测出番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒

菊花为常见栽培园艺花卉植物。从世博园采集的来自日本的菊花病株表现轻花叶 ,具有病毒病症状。日本为番茄环斑病毒 (ＴｏＲＳＶ)、南芥菜花叶病毒 (Ａｒ ＭＶ)、烟草环斑病毒 (ＴＲＳＶ)的疫区。这几种病毒的寄主范围广泛 ,易侵染草本花卉植物[1] ,因此用酶联、电镜和生物接种的方法对菊花病标样进行了诊断和鉴定。1　材料和方法1 .1　样品的采集和症状观察　样品采自世博园国际馆 ,并于检疫温室内隔离种植。以健康植物为对照 ,对样品进行症状观察和记录。1 .2　生物侵染实验　采用 0 .0 1ＭＰＢＳ(ｐＨ7.0 ) ,选用相关寄主 ,常规摩擦接种…     

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒.该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer 5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强.并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒.     

基于纳米磁珠-LAMP结合技术检测齿兰环斑病毒的初步研究

根据齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列,设计了LAMP检测引物,并结合纳米磁珠技术对齿兰环斑病毒进行LAMP检测。结果表明,只有齿兰环斑病毒毒株有扩增,而建兰花叶病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒毒株都没有扩增,说明本实验设计的LAMP检测引物具有检测齿兰环斑病毒的特异性。灵敏度实验结果表明,纳米磁珠-LAMP结合技术比RT-PCR方法高100倍。研究表明,纳米磁珠-LAMP结合技术检测方法是一种特异、灵敏、快速的齿兰环斑病毒检测方法。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用

为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记单抗C10并固定于胶金垫上;将抗体5B7和4F3分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠抗体包被固定于硝酸纤维素膜上作为质控线,经优化后组装胶体金试纸条。结果表明研制的联合试纸条特异性强,能够在10min之内同时检出两种病毒,操作简便。对两个种植苗圃的93份兰花样品进行实际检测所得结果与ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能满足兰花样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的初筛要求。