剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶Szpg6～Szpg10基因的分子检测及其序列分析

斑马纹病是剑麻生产上最严重、毁灭性病害之一。本研究基于寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg6~pppg10等5个基因c DNA序列设计了各基因编码区的特异引物。利用5对引物分别对不同来源的剑麻斑马纹病菌DNA进行了分子检测。检测结果表明,在被检测的剑麻斑马纹病菌菌株中均存在与寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg6~pppg10对应的基因Szpg6~Szpg10。基因序列比对分析表明,来自斑马纹病菌的Szpg6、Szpg8基因与对应pppg6、pppg8基因之间序列高度一致。比较而言,来自斑马纹病菌的Szpg7、Szpg9以及Szpg10基因与对应同源基因之间分别存在3、6及4个核苷酸序列差异,进而导致3、5及3个推定氨基酸的变异。由此推测,来自斑马纹病菌的Szpg7、Szpg9及Szpg10基因可能与对应基因在功能上存在着一定的差异。本研究为进一步研究剑麻斑马纹病菌多聚半乳糖醛酸酶在致病过程中的作用奠定了基础。     

剑麻斑马纹病菌EST-SSR标记开发与评价

剑麻斑马纹病是剑麻生产中具有破坏性的一种真菌病害。本研究从Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest)中随机下载10 525条寄生疫霉EST序列,经过去冗余处理后得到5 519条无冗余EST。利用MISA(MIcro SAtellite identification tool)软件进行SSR发掘,从中共搜索到199个1~6碱基SSR,其中三核苷酸重复基元类型最多,共鉴定到55个,占SSR总数的27.6%;其次是二核苷酸重复基元类型和单核苷酸重复基元类型,分别鉴定到51和47个,各占所鉴定SSR总数的25.6%和23.6%。进一步分析表明,AG/CT二核苷酸重复基元类型为优势重复类型,占二核苷酸SSR总数的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元类型在三核苷酸中出现频率最多,分别为15和11次,分别占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。从鉴定的199个SSR中,选取含有SSR的合适区段设计了22对引物,并通过18个剑麻斑马纹病菌菌株的基因组DNA进行了评价,结果只有其中9对引物能从剑麻斑马纹病菌基因组DNA中有效扩增,其扩增移效率为40.9%。由此表明,利用此方法来开发剑麻斑马纹病菌的分子标记具有可行性,只是存在一个转移效率问题。     

剑麻与烟草疫霉互作过程中的转录组研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,为了挖掘剑麻斑马纹病抗病相关基因,以斑马纹病抗病品种热麻1号为材料,分别在接种0、24、36、48和72 h进行转录组测序,组装后获得103 326个转录本和70 110个Unigenes,转录本和Unigene的平均长度分别为726 bp和645 bp。其中有33 474个Unigenes被成功注释到NR,NT,KO,Swissport等7个功能数据库中。DEG分析表明,在接种24、36、48、72 h后分别有4 676、3 769、3 308、3 757个Unigenes被诱导差异表达,且PR蛋白,类黄酮生物合成、苯丙素类生物合成、过氧化物酶等基因上调表达明显,而热击蛋白、细胞色素P450和叶绿素a/b结合蛋白等基因明显下调表达。差异基因代谢通路分析表明,参与核糖体、光合作用、苯丙素类生物合成、苯丙氨酸代谢通路、植物激素信号转导途径、类黄酮生物合成途径、脂肪酸生物合成途径等代谢通路明显富集。本研究全面了解剑麻与烟草疫霉互作关系,是为剑麻斑马纹病抗病机制研究提供理论基础。     

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2.CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸；CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸.2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54％的相...     

剑麻斑马纹病研究进展

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,严重影响了剑麻产业的发展。本文从斑马纹病病原菌种类及特征、斑马纹病主要症状及为害情况、斑马纹病的防治方法、防治中存在的问题及改进措施等方面进行综述,以期为剑麻斑马纹病的进一步研究提供参考。     

剑麻抗病基因Hevein的导入研究

剑麻是我国乃至世界热带地区最重要的麻类经济作物,用途广泛,综合利用价值高。而斑马纹病是剑麻生产上最为严重的病害之一,严重制约着剑麻产业的持续稳定发展。本研究通过农杆菌介导将抗病的Hevein基因导入,获得37株剑麻抗性植株,阳性率约为24.7%。经PCR检测,证明外源基因Hevein已成功整合到该剑麻植株的基因组中。并通过体外抑菌和抗病性检测,说明转基因剑麻植株中表达出一定的活性,而且还提高了对剑麻斑马纹病的抗性。研究结果为培育抗病高产转基因剑麻新品种奠定了坚实基础。     

大豆疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因的克隆及表达分析

大豆疫病严重影响我同及世界各国的农业生产,为探讨多聚半乳糖醛酸酶在大豆疫霉菌致病过程中的作用,采用PCR的方法从大豆疫霉菌中克隆了多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因,并利用RT-PCR法对其在大豆中的表达进行了分析.结果表明:大豆疫霉菌pspg1基因开放阅读框长1236 bp,编码一个长412氨基酸的蛋白质.对其进化关系进行分析,发现该基因与其它卵菌的pg基因亲缘关系最近,形成一个独立的分支.RT-PCR分析表明:pspg1基因在接种大豆疫霉菌的大豆下胚轴中大量表达,而在健康大豆下胚轴中未检测到.克隆了大豆疫霉菌pspg1基因,并发现该基因在大豆疫霉菌侵染大豆过程中发挥重要作用.     

剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发

下载Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因组序列,利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool),并按含有2~10个碱基重复、碱基数在18 bp以上的SSR基元为标准进行SSR鉴定。结果从A.niger ATCC 1015全基因组中,共发现4 000个2~10碱基SSR,其中含9个碱基重复基元类型最多,共有1 433个,占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型,共有753个,占SSR总数的18.8%;接着为3个碱基重复类型,共有547个,占13.6%。从鉴定出来的SSR中,选择含有SSR的合适区段,从中设计了36对引物,对剑麻茎腐病菌17个菌株的基因组DNA进行了PCR检测,发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增。由此表明,黑曲霉ATCC 1015菌株基因组SSR在剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、多样性和进化,定位和克隆功能基因等提供了分子标记。     

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgipl)原核表达及编码产物生物信息学分析

据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁(55.6%),信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键(第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸)。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复(LRR)结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)原核表达及编码产物生物信息学分析

 据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁（55.6%）,信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键（第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸）。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复（LRR）结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

基于转录组的剑麻SSR标记开发与筛选

本研究基于剑麻转录组测序获得的70 110条Unigene序列,采用MISA 1.0软件查找SSR位点,利用Primer 3.0设计SSR引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其中的100对SSR引物有效性进行验证。总计获得了13 175个SSR位点,SSR的分布频率为15.61%。70 110条Unigene序列总计包括60种重复基元,其中单核苷酸重复为主导重复类型（37.96%）,其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复,比例分别为32.92%和27.90%,四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复所占比例总计为1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。100对SSR引物中有68对引物可扩增出目标产物,其中18对引物在6份剑麻种质中表现出多态性,该结果为利用SSR分子标记技术开展剑麻种质资源鉴定、遗传多样性分析等奠定基础。     

剑麻AsLEC基因克隆及生物信息学分析

单子叶甘露糖结合植物凝集素基因能够有效抑制具有刺吸式口器的同翅目害虫的生长与繁殖,它被证实在掌叶半夏、小麦、烟草、棉花等单子叶和双子叶植物中均具有较好的抗虫效果,但其在剑麻中的功能尚缺乏深入研究。本研究以剑麻为材料,利用RT-PCR技术成功克隆剑麻lectin基因,命名为AsLEC,并对其进行生物信息学分析。结果表明:该基因CDS序列全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质分子量预测为19.97 ku,理论等电点为4.96,为疏水性蛋白;同源氨基酸序列比对结果表明剑麻lectin基因与火烧兰、雪花莲、君子兰与菠萝等植物的单子叶甘露糖结合凝集素基因同源性较高,氨基酸匹配度达到48%以上,系统进化树分析表明AsLEC基因与火烧兰亲缘关系更近;对AsLEC基因进行功能结构域分析表明其具有B-lectin基因家族典型特征,属于B-lectin基因家族成员;功能预测发现其具有一段33个氨基酸残基的信号肽,同时在N端第5~27位置处存在一个跨膜α螺旋,表明AsLEC蛋白为分泌型蛋白质,这与B-lectin蛋白的功能特点相吻合;AsLEC蛋白二级结构包含11个β折叠,3个α螺旋;亚细胞定位预测该基因很有可能定位在细胞膜上。剑麻AsLEC基因的克隆对于研究其在剑麻中的抗虫功能具有重要意义,同时丰富了单子叶植物中植物凝集素的相关研究成果。     

剑麻种质资源斑马纹病抗性鉴定及评价

通过大田鉴定与室内鉴定相结合的方法,对18份剑麻种质资源的抗病性进行了测定评价。结果表明:H.11648、K1、K3属于高感种质;普通剑麻、粤西114、东109、东5、东74、东16、南亚2和灰叶剑麻为中感种质;K2在大田鉴定为高感,而在室内鉴定为中感;广西76416、银边假菠萝麻为中抗种质;马盖麻为高抗种质;南亚1号大田鉴定为高抗种质,而室内鉴定为免疫种质;无刺番麻和番麻为免疫种质。     

分子标记辅助选择与花药培养相结合快速聚合水稻白叶枯病抗性基因

以受微效多基因控制白叶枯病抗性的五丰占2号和主基因[i]xa5[/i]控制的IRBB5为材料,应用分子标记辅助选择、花药培养和回交技术研究了主基因与微效多基因聚合的途径。经查阅GeneBank中RG556的序列,利用在线引物设计软件Primer 3设计了一条新的R引物：5′CCAGACACCACTGCACATTC3′,克服了原引物Tm值相差太大,扩增效率低的缺点,使PCR扩增效率提高了近10倍。采用病斑长度与五丰占2号相近且携有xa5基因的五丰占2号[sup]2[/sup]/IRBB5 B[sub]1[/sub]F[sub]1[/sub]植株进行花药培养,获得30株二倍体植株,其中16株携有[i]xa5[/i]基因。携有[i]xa5[/i]基因的植株的平均病斑长度仅0.1 cm,对白叶枯病的抗性明显强于双亲。成功地聚合了白叶枯病抗性主基因和微效多基因。从配组到获得主基因和微效多基因聚合材料仅用两年时间,比常规育种方法缩短1~2年。     

应用SSR分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度

 应用SSR分子标记技术对超级杂交稻5个组合（HYS 1/R105、培矮64S/E32、两优培九、88S/0293、J23A/Q611）及其9个亲本进行了鉴定。用144对SSR引物进行筛选，有47对能够在实验材料中显示较好的多态性，其中，RM337与RM154呈现丰富多态性，可鉴别供试组合并分别与其亲本区分开。对于水稻的每一条染色体，各筛选出两条产生多态性的引物，共24对，并提供一组作为鉴定参考的图谱；通过杂种表现为父母本互补带型的特点，找到在杂交稻组合及其亲本间具有多态性的引物，筛选出5对引物分别作为鉴定上述5个超级杂交稻组合的特异引物，进而针对杂交稻不同的纯度问题设计鉴定方法。     

Mapping of Rice Fertility-Restoring Genes for ID-Type Cytoplasmic Male Sterility in a Restorer Line R68

An F2 population derived from the cross Zhong 9NR68 was used to map the fertility-restoring (Rf) gene for ID-type cytoplasmic male sterility (CMS).Two bulks (a fertile bulk and a sterile bulk) were constructed by pooling equal amount of ten highly fertile lines and ten highly sterile lines,respectively.Four hundred and thirteen pairs of simple sequence repeat (SSR) primers,which evenly distributed on 12 chromosomes of rice,were selected for analyzing polymorphisms between the parents and between the two bulks.The primer RM283 on chromosome 1 and the primers RM5756,RM258,RM6100 and RM171 on chromosome 10 were found to be polymorphic between the parents and between the two bulks.These five SSR markers were linked to fertility-restoring genes.A total of 82 excessive sterile lines were selected from Zhong 9NR68 F2 population to estimate the genetic distance between five SSR markers and fertility-restoring genes respectively.The results indicated that one Rf gene was linked to RM283 located on chromosome 1 at a distance of 6.7 cM,and the other Rfgene was mapped to the long arm of chromosome 10 flanked by RM258 and RM6100 at the distances of 8.0 cM and 2.4 cM,respectively.     

Identification and Purity Test of Super Hybrid Rice with SSR Molecular Markers

Five super hybrid rice combinations, i.e. HYS-1/R105, Pei‘ai 64S/E32, Liangyoupeijiu (Pei‘ai 64S/9311), 88S/0293, and J23A/Q611, and their parental lines were tested by means of SSR analysis. A total of 144 SSR primer pairs distributed on 12 rice chromosomes were used, out of which 47 detected polymorphism among the tested rice lines. Among all these primers, RM337 and RM154 produced polymorphic patterns in four or more of the tested experimental materials respectively, and they could distinguish among most rice genotypes tested. Twenty-four primer pairs, two on each rice chromosome, were selected to make a reference SSR marker-based fingerprinting for the rice lines. For most of the primer pairs, F1 hybrids mainly showed complementary pattern of both parents, which could be very useful to distinguish the F1 from its parental lines. In addition, 5 primer pairs were selected as special primer pairs for five hybrid rice combinations respectively. By combining the rapid, simple method on DNA extraction, it is suggested that SSR technique has wide prospective in variety authentication and purity identification.