拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用

【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体，并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列，将其克隆至原核表达载体pET-28a中，转化到BL21（DE3）表达菌，经IPTG诱导后，对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔，从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列，将其克隆至植物表达载体pBI111L中，再转化到农杆菌GV3101中，利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1 T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列，成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体，实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达（包涵体）。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列，成功构建了pBI111LP-PRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体，用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54 ku的蛋白，该蛋白在prl1点突变体中表达量下降，在PRL1 T-DNA插入突变体中缺失，而在prl1回复株系中表达量升高，并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体，可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。     

猪c-Myc蛋白多克隆抗体的制备

【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体，同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体，为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-Myc全基因序列(GenBank No. NM＿001005154)设计引物，以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列，经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)；转化至Arctic-Express^TM大肠杆菌后诱导表达；表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后，用间接ELISA法测定其效价，用Western blot检测其特异性。【结果】经检测，克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1 359 bp,c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现，分子质量约为63 kDa，由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1 093 500，并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。【结论】...     

拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1ng原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒（New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV）Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析，选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487～627 aa，后全基因合成序列，并在其C末端添加His-tag标签，利用无缝克隆的方法，将该段基因克隆至pET-28a(+)载体，随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌，诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔，制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒，纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa，主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性，可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位，满足进一步研究的需要。     

拟南芥Mg2+转运蛋白AtMGT10的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】在大肠杆菌系统中原核表达拟南芥叶绿体Mg~(2+)转运蛋白AtMGT10,通过免疫健康成年家兔,获得针对AtMGT10蛋白的多克隆抗体,为研究AtMGT10蛋白在植物生长发育中的功能奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆AtMGT10基因编码区187~786bp的cDNA片段,连接到pET-28a中构建原核表达载体pET-28aAtMGT10~(63-262),转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带有His标签的His-AtMGT10~(63-262)截短重组蛋白。用镍柱亲和纯化后的重组蛋白作为抗原皮下注射免疫家兔,制备针对AtMGT10蛋白的多抗血清。提取拟南芥野生型叶片总蛋白,用AtMGT10多抗血清进行蛋白免疫印迹检测。【结果】经PCR扩增获得了600bp的AtMGT10基因cDNA片段,成功构建原核表达载体pET-28a-AtMGT10~(63-262),在大肠杆菌系统中表达出His-AtMGT10~(63-262)蛋白,经亲和纯化后免疫家兔获得了Anti-AtMGT10多抗血清。在拟南芥野生型总蛋白中用Anti-AtMGT10经免疫印迹检测到大约50ku的蛋白条带,利用抗原竞争试验进一步证明检测到的信号就是拟南芥内源AtMGT10蛋白。【结论】原核表达了His-AtMGT1063-262蛋白,成功制备了特异性较强的AtMGT10蛋白多克隆抗体。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因（即T基因）编码区（CDS）,并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB（DE3）大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA（iELISA）法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1 335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白 A 的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1 071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形...     

康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

奶山羊EGFR蛋白胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。通过Ni-Charged MagBeads纯化重组蛋白后免疫2月龄白色獭兔,采用间接ELISA(iELISA)法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】PCR扩增得到1 860bp的EGFR胞外区基因序列,成功构建pET-32a(+)-ECD载体。加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG,于37℃诱导表达6h成功得到重组蛋白,该蛋白分子质量约94ku,且为以包涵体形式存在的变性蛋白。iELISA检测抗体效价为1∶16 000;Western blot检测表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的ECD蛋白及在山羊乳腺上皮细胞和HEK293细胞中的EGFR蛋白。【结论】成功制备山羊EGFR多克隆抗体,该抗体可以用于科研试验。     

玉米ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表达及抗体制备

【目的】制备玉米三磷酸甘油醛（GAPDH）和肌动球蛋白（ACTIN）的多克隆抗体,检测热激条件下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达,为将ZmGAPDH和ZmACTIN作为非生物胁迫下的内参基因奠定基础。【方法】利用DNAMAN 7对ZmGAPDH和ZmACTIN与不同植物同源蛋白间的氨基酸序列进行比对。通过PCR克隆ZmGAPDH和ZmACTIN的CDS,将其构建到原核表达载体pET-28a中并测序;将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21（DE3）和RG2, 用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达;将目的蛋白透析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。利用RT PCR和Western blot检测42 ℃热激不同时间（0,2,4,8 h）下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN mRNA及其蛋白的表达水平。【结果】克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN基因的CDS序列,成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN。在大肠杆菌中表达出了玉米ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白,将纯化的蛋白免疫家兔后获得了多抗血清。ZmGAPDH多克隆抗体能清晰检测到4 ng原核表达的ZmGAPDH抗原,ZmACTIN多克隆抗体同样能够清晰检测到4 ng原核表达的ZmACTIN抗原。热激不同时间下玉米B73叶片中的ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白表达水平一致,mRNA丰度稳定不变。【结论】成功制备了ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白多克隆抗体;ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因,用于检测热激条件下目标基因的表达水平。     

玉米ZmICS1和ZmSARD1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将玉米异分支酸合成酶1（ZmICS1）及系统获得抗性缺陷1（ZmSARD1）进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。【方法】克隆玉米ZmICS1和ZmSARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达His_×6-ZmICS1和His_×6-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。【结果】成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37 ℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2（DE3）中诱导出His_×6-ZmICS1和His_×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His_×6-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His_×6-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。【结论】成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。     

马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)外壳蛋白基因的克隆、表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】制备马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVY^N）多克隆抗体,建立间接ELISA法用于检测PVY^N病毒。【方法】依据PVY^N的CP基因序列设计引物,利用RT-PCR方法获得CP基因并连接构建到原核表达载体,进行原核表达,以纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得PVY^N的抗血清并纯化。【结果】测序结果与其他已知序列比较,PVYNCP基因的核苷酸同源性95%,推断氨基酸的同源性达98%。以纯化蛋白为抗原进行免疫,成功获得了PVY^N外壳蛋白抗血清,纯化后的IgG采用间接ELISA法检测抗原,抗体效价达1：500,使用该抗体稀释度检测感染植株,结果呈阳性。【研究结论】通过分子生物学途径获得了PVY^N的多克隆抗体,建立的间接ELISA方法可以用于PVY^N的病毒检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。