外源MeJA对低温胁迫下冬小麦冷响应基因表达的影响

为了探讨外源MeJA(茉莉酸甲酯)处理对低温胁迫下东农冬麦1号(Dn1)叶片和分蘖节中 TaICE41(CBF表达诱导因子)及4个冷响应基因( Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413)表达量的影响,了解Dn1强抗寒性是否与JA(茉莉酸)对CBF途径冷响应基因的调节有关,以Dn1为试验材料,叶面喷施1mmol·L~(-1)MeJA,采用荧光定量PCR法检测低温(5℃、0℃、-10℃和-25℃)胁迫下Dn1叶片及分蘖节中 TaICE41及下游4个冷响应基因的表达量。结果表明,外源MeJA处理提高了低温胁迫下Dn1叶片及分蘖节中上述基因的表达量;-10℃下,Dn1分蘖节中 TaICE41、 Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413表达量均达到最高值,处理组依次约为对照组的3.3倍、38.0倍、12.7倍、9.4倍、3.5倍,表明JA对CBF途径冷响应基因的调节与低温胁迫下Dn1的强抗寒性有关;-10℃是Dn1抗寒的重要温度节点,分蘖节是影响其越冬性的主要部位。生物信息学分析及预测表明, TaICE41位于3A染色体上,定位于细胞核内,表达产物为无规则卷曲型蛋白,属于HLH蛋白家族成员,与节节麦的ICE1蛋白亲缘关系最近。本研究可为解析激素JA调控植物抗寒性的分子机制提供理论依据。     

东农冬麦1号TabZIP1基因的生物信息学分析及低温和ABA对其表达模式的影响

为探讨小麦中TabZIP1应答低温胁迫及ABA调控信号的响应机制,以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号(DN1)和弱抗寒性品种济麦22(JM22)为材料,在大田自然降温条件下,分别于5℃、0℃、-10℃、-25℃取样叶片和分蘖节,通过RT-PCR分析TabZIP1的表达模式,于不同温度下探究ABA对DN1分蘖节TabZIP1表达模式的调控,并对其生物信息学进行分析。结果表明,TabZIP1全长1 167bp,编码388个氨基酸,其表达产物为疏水蛋白,定位于线粒体,无信号肽或跨膜结构域;TabZIP1蛋白二级结构为mixed型。DN1叶片和分蘖节中的TabZIP1表达量均在-10℃时达到最高,且分蘖节中的表达量高于叶片;而JM22分蘖节中的TabZIP1表达量在0℃时达到峰值,叶片中的表达量却在-10℃达到最高。综合分析,DN1分蘖节中的TabZIP1表达量明显高于JM22。ABA处理后,DN1分蘖节中TabZIP1的表达量随温度的降低呈明显升高趋势,在-25℃时达到峰值。可见,ABA正调控TabZIP1的表达,有助于提高冬小麦的抗寒性。     

东农冬麦1号TaPRK基因的生物信息学分析及低温和ABA、SA、MeJA对其表达模式的影响

磷酸核糖激酶(PRK)是卡尔文循环的关键酶,在调节糖代谢过程中起着关键作用。为探索TaPRK在小麦抗逆过程中的功能,以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)和弱抗寒冬小麦品种济麦22(J22)为材料,对TaPRK进行生物信息学分析和表达模式研究。结果表明,TaPRK基因含有一个1 215bp开放阅读框,编码404个氨基酸,表达产物为稳定的亲水蛋白,属于尿苷激酶家族,带有叶绿体转运肽,定位于叶绿体。越冬期间,Dn1分蘖节中TaPRK的相对表达量显著高于J22,Dn1叶片中TaPRK的相对表达量在-10℃和-25℃时高于J22,而在0℃时低于J22;外源ABA、SA和MeJA处理下,Dn1分蘖节中TaPRK的相对表达量均随着温度的降低表现为先升后降的趋势,且均在-10℃时达到表达量的峰值;外源ABA和SA处理下Dn1叶片中TaPRK的相对表达量呈现"降-升-降"的变化规律,在-10℃时显著高于对照;外源MeJA处理下,Dn1叶片中TaPRK的相对表达量在0℃和-25℃高于对照,且在0℃达到峰值。总体来说,TaPRK在小麦抗寒方面发挥正向调节作用。外源ABA、SA和MeJA增加了冬小麦TaPRK的表达量,有助于提高冬小麦的抗寒性。     

外源SA对低温胁迫下冬小麦糖酵解代谢的影响

为揭示SA处理对低温胁迫下冬小麦糖酵解（glycolysis,EMP）代谢的影响,以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）和弱抗寒性品种济麦22号（Jm22）为试验材料,在小麦幼苗三叶期喷施 1 mmol·L^-1 SA,于大田连续10 d自然降温至5、0、-10、-25 ℃时取小麦幼苗叶片和分蘖节,测定其果糖含量、丙酮酸含量及EMP代谢重要酶（己糖激酶HxK、磷酸果糖激酶PFK和丙酮酸激酶PK）的活性和相关基因（TaHxK、TaPFK、TaPK）的表达量。结果表明,SA处理提高了两种冬小麦叶片和分蘖节中果糖及丙酮酸含量,但对Jm22影响较弱;SA处理提高了Dn1叶片和分蘖节中EMP途径关键酶（HxK、PFK和PK）的活性及其相应基因（TaHxK、TaPFK、TaPK）的表达量。SA处理可有效调控冬小麦EMP代谢,促进果糖与丙酮酸积累与分解,提高植物的抗寒性。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wrab17基因表达的影响

为了探索油菜素内酯（BR）对低温胁迫下 wrab17基因表达模式的影响,以寒地冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,利用qRT-PCR技术克隆得到 wrab17基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该序列的特征,采用qRT-PCR技术检测低温（5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃）胁迫下该基因在冬小麦叶片和分蘖节中的表达情况以及BR对 wrab17基因表达量的影响。结果表明, wrab17基因的编码区序列长度为735 bp,包含500 bp的完整开放阅读框,可编码167个氨基酸,属于稳定蛋白质,该蛋白质无跨膜区和信号肽。qRT-PCR分析表明,低温胁迫下对照组和BR处理组的Dn1叶片和分蘖节中, wrab17基因的相对表达量分别在-10 ℃和-25 ℃时最高,且BR处理组 wrab17基因的相对表达量均高于对照组,推测BR可通过提高 wrab17基因的表达量来增强冬小麦的抗寒能力。     

木薯中lncRNA-CRR5在低温胁迫下的功能分析

低温胁迫严重影响木薯的生长、产量以及块根品质。长链非编码RNAs（lncRNAs）作为关键的调节因子,在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要的功能。然而,lncRNAs在木薯中的功能和调控机制尚无报道。因此,为了研究木薯lncRNAs在低温胁迫应答中的功能,本研究以木薯主栽品种‘60444’为材料,利用低温处理前后的叶片转录组数据,鉴定到一个受低温胁迫调控的lncRNA（cold-responsive lncRNA5,CRR5）。通过对其序列比对进行同源性分析, RNA二级结构预测和共表达分析鉴定来分析lncRNA-CRR5响应低温胁迫的分子功能。并根据基因的共表达分析推测CRR5的顺式作用和反式作用靶基因。这些结果为更进一步研究CRR5的功能提供了理论依据。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦wcor413-like基因表达的影响

为探索低温胁迫下油菜素内酯(BR)对冬小麦分蘖节及叶片 wcor413-like基因表达的影响,以寒地冬小麦东农冬麦1号为试验材料,利用RT-PCR法克隆 wcor413-like基因的cDNA序列,用生物信息学法分析该序列的特征,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测5℃、0℃、-10℃和-25℃四个温度处理下分蘖节和叶片中 wcor413-like基因的表达量。结果表明, wcor413-like基因含有一个629 bp的开放阅读框,可编码209个氨基酸,编码的wcor413-like蛋白为稳定蛋白质,主要分布在细胞质中。qRT-PCR分析表明,在叶片中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈现先上升后下降的变化趋势,-10℃时表达量最高;在分蘖节中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈持续上升的趋势,-25℃时表达量最高。BR处理后的叶片和分蘖节中, wcor413-like基因的表达量均在-25℃时达到最高,叶片中该基因的表达量显著高于对照组,而分蘖节中该基因的表达量显著低于对照组。推测BR可通过调控叶片和分蘖节中 wcor413-li...     

低温胁迫下冬小麦JA合成相关基因的研究

植物激素JA在植物响应低温胁迫中发挥重要的作用。本课题组前期研究发现,东农冬麦1号(Dn1)的强抗寒性与JA信号转导有关,为了探讨Dn1抗寒性的提高是否与内源JA合成基因的表达有关,以Dn1为试验材料,外施MeJA处理,对不同温度胁迫下JA合成基因(TaLOX1、TaLOX2、TaLOX3、TaAOS、TaAOC、TaOPR2、TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D)的表达量进行实时荧光定量分析,并结合生物信息学分析对TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白功能进行预测。结果表明,低温胁迫提高了Dn1分蘖节中TaLOX1、TaLOX3、TaAOC和TaOPR2的相对表达量,在-10℃表达量达到最大值;外源MeJA处理显著提高了0℃下分蘖节中TaLOX1、TaLOX2、TaLOX3、TaAOS、TaAOC的相对表达量;TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D基因均位于小麦5号染色体上,编码的蛋白均定位于细胞质中,属无规则卷曲蛋白,结构相似,保守结构域相同,蛋白功能相同或相似。本研究为进一步揭示JA合成基因在冬小麦响应抗寒中的作用奠定了基础。     

冬小麦miR172响应抗寒的特征分析

东农冬麦1号（Dn1）是我国首个能在黑龙江省高寒地区安全越冬的强抗寒冬小麦品种。为了解tae-miR172在Dn1抗寒中的调控机制，本研究克隆了Dn1中tae-miR172的前体pre-tae-miR172，根据生物信息学分析预测其靶基因为AP2dn1(TraesCS5D02G486600)。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达试验，进一步证明tae-miR172靶向AP2dn1；利用qRT-PCR技术对大田越冬期Dn1分蘖节中pre-tae-miR172和Ap2dn1的相对表达量进行分析。结果表明，pre-tae-miR172的表达量随温度降低呈先升后降的变化趋势，而靶基因Ap2dn1的表达量变化趋势则相反，说明tae-miR172负调控Ap2dn1的表达。     

水分胁迫条件下冬小麦幼苗应答蛋白的表达及其与品种抗旱性的关系

为了探索冬小麦幼苗期水分胁迫D-应答蛋白与品种抗旱性的关系,以30个抗旱性不同的冬小麦品种为材料,采用正常供水和-1.0 MPa PEG-6000胁迫两种处理及SDS-PAGE电泳技术,在抗旱性研究的基础上,对水分胁迫与非胁迫条件下D-应答蛋白在不同品种间表达的差异进行分析.结果发现,抗旱和中等抗旱品种经胁迫诱导后产生D-应答蛋白条带,而干旱敏感品种中没有出现此条带.该应答蛋白的分子量与已报道的抽穗期的分子量相当,约为66.2 kD.说明冬小麦幼苗期经水分胁迫后产生的D-应答蛋白与抽穗期水分胁迫后产生的应答蛋白完全一样,可以作为鉴定抗旱性的应答蛋白指标.     

巴西橡胶树HbHsfA4a的克隆及其对低温胁迫的响应

热激转录因子(Hsf)是植物响应非生物胁迫的重要调节因子。本研究利用RT-PCR技术从橡胶树93-114叶片中克隆到一个Hsf转录因子,命名为HbHsfA4a。该基因开放阅读框为1215bp,编码404个氨基酸,其蛋白质分子量为46.40 ku,等电点为4.91。实时荧光定量PCR结果表明,低温(4℃)胁迫下HbHsfA4a在抗寒性强的橡胶树无性系93-114树皮中受低温诱导大幅上调表达,而且显著高于抗寒性弱的橡胶树无性系热垦501。进一步分析结果表明,HbHsfA4a在抗寒性强的2个橡胶树无性系中的本底表达量和低温胁迫8 h内的表达量均显著高于抗寒性弱的2个橡胶树无性系。HbHsfA4a基因可能在橡胶树应对低温胁迫中起着重要的调控作用。     

利用WGCNA鉴定甘蓝型油菜低温胁迫的基因共表达网络

为了解甘蓝型油菜受低温胁迫时的共表达网络,运用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expres⁃ sion network analysis, WGCNA）方法,利用2个抗冻响应有差别的甘蓝型油菜材料HX17和HX58不同低温处理的36 个RNA-seq数据,通过过滤低表达基因,筛选表达水平变异最大的前15 000个基因用于WGCNA分析,共鉴定到16 个基因共表达模块。结合转录因子预测、冷相关基因预测、模块基因的gene ontology（GO）富集及表达分析,确定了 brown模块为响应冻害胁迫的共同模块、pink模块为HX17耐寒特异性模块,并构建了基因共表达网络,为油菜抗寒/ 抗冻机制研究提供新的依据。     

转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T₂代甘蔗株系进行PCR扩增及测序,从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理,在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下,6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相对表达量始终高于WT甘蔗,低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下,甘蔗的MDA含量逐渐增高,而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗,10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同,但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势,而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升,转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗,胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价,抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下,转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性,且具有遗传稳定性。     

木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其对低温胁迫的响应

本研究从全基因组水平对木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶编码基因（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）进行鉴定,并以木薯品种KU50为材料克隆了6个PAL基因,分析了低温胁迫（7 ℃）对叶片MePAL表达模式、PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的影响。结果表明：低温处理使木薯叶片迅速萎蔫卷曲,并伴随叶片PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的显著提高。Real-time PCR分析表明,在低温处理前,MePAL1和MePAL2的相对表达量分别为0.83和1.19,显著高于其他4个MePAL基因,低温处理后6个MePAL基因均不同程度受低温胁迫诱导增强表达,其中MePAL5上调最高,达50.5~142.5倍。本研究结果初步显示低温胁迫上调了木薯叶片MePAL的表达,促进了总酚和类黄酮的合成,提高了抗氧化损伤的能力。     

花生中蔗糖合成酶基因AhSuSy在花生中的组织表达及对非生物胁迫响应研究

低温、高盐和干旱胁迫严重影响植物的生长和产量。本研究以花生品种花育33号为实验材料,根据cDNA文库中已知的蔗糖合成酶基因AhSuSy全长序列设计引物,通过RT—PCR克隆到该基因。通过荧光定量PCR分析了该基因在花生各组织中的表达及在低温、高盐等非生物胁迫下的表达。结果显示,该基因为组成型表达基因,在叶片和根中表达量较高,在花中表达量最低;AhSuSy基因在花生的叶片和根中对低温均没有明显响应,但在花生根中受高盐胁迫和干旱胁迫明显诱导,说明该基因可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控;AhSuSy在花生根中受ABA的明显诱导,说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。     

大豆GmbZIP33基因启动子的克隆及瞬时表达分析

启动子作为基因调控的重要元件,决定着下游基因表达的时空和强度特性。为研究大豆GmbZIP33基因启动子功能,在前期克隆获得GmbZIP33基因(Glyma.03G219300.1)序列的基础上,通过N-PCR(nested PCR)技术克隆了GmbZIP33 CDS上游启动子区序列(2 316 bp)。利用PlantCARE在线分析软件进行顺式作用元件的预测,发现该序列上除含有TATA-box和CAAT-box等核心调控元件外,同时包括与抗逆、光响应、激素响应、蔗糖应答元件和多个与组织特异性表达相关的元件。为研究GmbZIP33启动子的表达调控特性,构建了该启动子调控报告基因GUS表达的载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥中,发现该启动子驱动下的GUS基因在不同组织(莲座叶、花、荚果和根)的维管束中均特异性表达;对转基因拟南芥进行实时荧光定量PCR检测发现,GUS基因在花中表达量最高,荚果中次之,表明GmbZIP33基因可能受到多种因素和蔗糖的调节并参与花荚发育的调控。