柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

柑橘芽变选种以及芽变性状形成机理研究进展

综述了柑橘芽变选种的成果。近年来,我国选育了崀丰、长红、新世纪、奉晚等脐橙品种和华柑2号椪柑、岩溪晚芦、光明早温州蜜柑等宽皮柑橘品种,还有锦橙101、红肉琯溪蜜柚等其他柑橘品种。介绍了RAPD、AFLP、ISSR、MSAP和基于反转录转座子的分子标记在柑橘芽变品种鉴别中的应用。阐述了部分柑橘芽变性状形成的细胞学机理和分子机理,指出目前对芽变的研究主要集中在反转录转座子的插入、DNA甲基化、基因结构和表达差异等方面。结合果树芽变研究的现状,对今后进行芽变研究提出了展望。     

利用转座子显示技术鉴别柑橘芽变品种

在依据柑橘全基因组信息的基础上,针对转座子序列开发了一种适合鉴别柑橘芽变品种的分子技术。以43个柑橘芽变品种和7个普通柑橘品种为材料,采用转座子显示技术(transposon display,TD)对转座子进行多态性分析。结果表明:5个DNA转座子(DTM63、DTM58、Helitron1、Spem和mPing2)和4个反转录转座子(Line1、LTR-Gypsy3、LTR-Gypsy5和Tcs2)可以较好地鉴别柑橘不同芽变品种。罗伯逊脐橙及其早熟芽变品种罗脐35号能被DTM63、Spem和mPing2鉴别;m Ping2能鉴别罗伯逊脐橙/罗脐35号、暗柳/红暗柳、普通椪柑/黔阳无核椪柑,以及红肉琯溪蜜柚/橙皮琯溪蜜柚这4对芽变品种。DNA转座子DTH3在甜橙芽变品种中多态性高,可以鉴别不同的甜橙芽变品种。因此,TD技术是一种值得关注的能有效鉴别柑橘芽变品种的分子标记技术。     

基于STR位点对广东省柑橘溃疡病菌种群遗传结构的分析

柑橘溃疡病是柑橘生产上最严重的病害之一，由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri pv. citri,Xcc）引起。为了全面系统地研究广东省柑橘溃疡病菌的种群遗传结构，通过比对分析已报道的中国8个柑橘溃疡病菌全基因组序列的串联重复位点（ShortTandemRepeat,STR），筛选出6个高度变异位点，对广东省的15个市（县）14个品种共352个柑橘溃疡病菌菌株进行遗传多样性分析。结果表明，基于遗传多样性和遗传距离对广东省不同地区的柑橘溃疡病菌株鉴定出6组类群：潮州和汕尾为Ⅰ组，梅州和河源为Ⅱ组，肇庆、广州、江门、佛山和惠州为Ⅲ组，阳江、茂名和湛江为Ⅳ组，云浮为Ⅴ组，韶关和清远为Ⅵ组。基于遗传多样性和遗传距离对广东省不同品种的柑橘溃疡病菌株鉴定出5组类群：沃柑、贡柑、朱砂橘、砂糖橘、茶枝柑、红江橙、马水橘为Ⅰ组，脐橙和柠檬为Ⅱ组，蕉柑、茂谷柑和春甜橘为Ⅲ组，沙田柚为Ⅳ组。     

柑橘叶脉开裂症与矿质营养的关系

 柑橘叶脉开裂症属于多病因的病症,缺Mg或缺B均可导致发病。对‘纽荷尔’脐橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck‘Newhall’]的缺Mg叶脉开裂症病株,在生长季4月采用1.0%硝酸镁叶面喷施矫治2 ~ 3次,可有效降低病叶发生。通过福建柑橘产区普查,由缺Mg引起叶脉开裂症占86.2%,其次为B与Mg共同缺乏,缺B仅占2.3%。不同品种缺Mg叶脉开裂的感病顺序为：纽荷尔脐橙＞琯溪蜜柚,其它发病品种还有金柑、早熟温州蜜柑、瓯柑。采用易感品种纽荷尔脐橙与抗性品种椪柑互为中间砧高接比对发现,纽荷尔脐橙对Mg和B的吸收能力低于椪柑,对K的吸收高于椪柑,这可能是纽荷尔脐橙易患叶脉开裂症的原因。缺Mg和缺B病症的最显著的区别为,缺Mg叶脉开裂多位于叶片顶部“∧”形黄化部位;缺B叶脉开裂症病叶呈绿色不黄化;Mg、B缺乏症的病叶主脉和侧脉明显开裂与全叶黄化,或叶脉开裂达基部“∧”形绿色区域。     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

柑橘黄龙病检测技术概述

中国是世界上重要的柑橘生产国，生产面积第一，产量也达到了世界第二位。但在柑橘产业的发展当中，病虫害严重制约了发展速度，特别是柑橘黄龙病（citrus huanglongbing，HLB）。由于柑橘种类、品种繁多，砧穗组合比较复杂，而且，即使是同一品种甚至同一植株，在自然情况下可感染多种病害，而不同的病害又有不同的症状，所以加大了其田间诊断的难度。     

湖南省柑橘品质鉴定及区划研究

对湖南省柑橘的主要栽培种类早熟温州蜜柑、脐橙、糖橙、椪柑、柚的22个品种的果实品质进行了鉴定,结果表明,兴津、山下红早熟温州蜜柑,纽荷尔、萘维林娜、福本、崀丰脐橙,糖橙类及菠萝香柚等品种果实品质优良。资兴东江库区、石门、洞口、安化及相似生态小区可划为早熟温州蜜柑优质栽培区;道县、茶陵、新宁、会同、资兴、临武、宁远、武冈、宜章、耒阳、新田可划为纽荷尔脐橙优质栽培区;麻阳、洪江、永兴划为冰糖橙优质栽培区;吉首、泸溪、芝山可划为优质椪柑栽培区;江永、慈利可分别划为沙田柚和菠萝香柚优质栽培区。     

琯溪蜜柚黄龙病的田间诊断及防控技术

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害。中国有柑橘栽培的19个省（区）中已有11个遭受黄龙病为害。在柑橘类中至今未发现抗黄龙病品种与穗砧组合,但品种问抗性有差异。桠柑、蕉柑、福橘感病后迅速衰退;温州蜜柑和甜橙相对耐病;柚类与金柑较耐病。枳（Poncirus trifoliata）感病不表现症状,但无助于改变接穗的抗性。黄龙病病原被认为是一种分布限于韧皮部筛管细胞且难培养的革兰氏阴性细菌,国内外虽有成功培养的报道,但均未获得广泛的认同。     

蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2 finger基因的克隆与表达分析

 在26S泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解过程中,RING finger蛋白是一类特殊的泛素蛋白连接酶,参与植物多个生长发育及逆境胁迫响应过程。为探明柚RING finger家族成员的序列特征及表达模式,从红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实汁胞中分离出两个RING finger基因cDNA片段（CgRHF1和CgRHF2）,采用实时荧光定量PCR研究其在不同组织及果实发育不同时期的表达模式。结果表明,两个基因均属于RING-H2 finger家族成员,且红肉蜜柚与琯溪蜜柚的两个CgRHF之间碱基序列均无差异;除根组织外,CgRHF1表达水平较CgRHF2高,且在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达水平显著高于琯溪蜜柚;CgRHF2在组织及果实发育过程表达水平均较低,但在果实成熟采摘阶段急剧上升。CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能,而非功能互补基因。     

应用DTBIA技术快速检测柑橘黄龙病菌研究

柑橘黄龙病病原菌为韧皮部限制性寄生菌Candidatus Liberibacter,迄今为止尚未成功获得离体纯培养。因此基于特异性抗体的高通量血清学检测技术迄今尚未开发。本实验室前期研究利用异源表达重组黄龙病菌外膜蛋白Omp_(CLas)免疫动物,制备并获得了特异性多克隆抗体(Anti-Omp_(CLas)-Pab)。本研究利用直接组织印迹免疫法(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)技术对获得的多克隆抗体的检测效果进行了初步评价,证实该抗体可以特异性识别中国不同地理来源的柑橘黄龙病菌分离物;柑橘叶柄、叶片中脉、枝条、根部、果梗和种子中均存在黄龙病菌,其中根部和种子中的病菌含量相对较低,枝条和叶片中脉中的含量较高。该多克隆抗体的获得为后续快速检测试剂盒或试纸条的研发奠定了基础。     

柑橘品种成熟期差异化的利用及防止

<正>柑橘果树的种植因受地域生态环境和栽培技术的影响,同一个品种在不同种植区域,或种植在同一园地的柑橘果实的成熟时间有差异,也称品种成熟期差异化。品种成熟期差异化表现在宏观和微观两方面:宏观方面,是指同一个柑橘品种在不同气候带的生态环境种植,发生了物候期的早晚变化,进而影响柑橘果实成熟期的早晚。对品种的这种成熟期差异化,可加以利用:通过品种合理的区域布局,使柑橘提前、延后应市取得好的经济效益。     

柑橘落花落果的营养元素含量及其脱落损耗

 以成年纽荷尔脐橙、兴津温州蜜柑和沙田柚为材料,研究落蕾、落花和脱落幼果中的养分 含量及其脱落造成的损耗。结果表明,3 个品种的蕾和花营养元素含量为N 3.34% ~ 3.66%,P 0.26% ~ 0.31%,K 1.67% ~ 2.30%,Ca、Mg 和S 含量0.17% ~ 0.48%,Fe、Mn、Zn、Cu 和B 含量8.1 ~ 87.5 mg · kg^-1。 除花的B 含量显著高于蕾外,花和蕾的多数营养元素含量相近,且品种间差异小。与蕾和花相比,幼果 的N 和P 含量较少,N 和P 含量分别少21.8%和19.5%,但Fe 含量较多,其它营养元素含量变化不明显。 纽荷尔脐橙、兴津温州蜜柑和沙田柚单株脱落的蕾、花和幼果干物质量合计分别为3 016.3 g、3 533.6 g 和1 486.7 g,由此所造成的单株主要养分损耗为N 49.2 ~ 119.4 g、P 4.3 ~ 10.1 g、K 30.1 ~ 76.2 g、Mg 2.5 ~ 7.1 g、Zn 24.0 ~ 81.5 mg 和B 65.5 ~ 170.2 mg。兴津温州蜜柑和沙田柚均以落花的养分损耗最大,落蕾其 次,落果最小;纽荷尔脐橙则是落花和落蕾的养分损耗相近且远高于落果。品种间以兴津温州蜜柑脱落 的养分损耗最大,纽荷尔脐橙其次,沙田柚最小。因此,柑橘应控制过量开花,并在萌芽开花期及时补 充养分。     

与呼吸跃变型果实共贮藏改善柑橘果实色泽和品质

选择9种常见园艺果实分别与纽荷尔脐橙果实进行采后共贮藏,结果表明：与呼吸跃变型果实（香梨、猕猴桃、番茄、香蕉）共贮藏（storage with climacteric fruits,SWCF）处理可以显著促进纽荷尔脐橙果皮转红,其中香梨的效果最佳。高效液相色谱分析显示,SWCF处理促进纽荷尔脐橙果皮总类胡萝卜素、β–柠乌素、β–隐黄质和紫黄质含量增加3倍左右。其中,β–柠乌素的积累是SWCF处理促进柑橘果皮转红的主要原因。实时荧光定量PCR结果显示,SWCF处理显著激活了类胡萝卜素代谢基因的表达,特别是类胡萝卜素裂解双加氧酶4b基因（Carotenoid cleavage dioxygenase 4b,Cs CCD4b）最大被激活了约20倍,这是SWCF处理促进β–柠乌素积累的直接原因。进一步研究发现,SWCF处理改善果皮色泽对各品种柑橘具有普遍性。此外,与乙烯处理相比,SWCF处理显著降低了柑橘果蒂衰老率、失重率以及果皮蜡质的降解,增加了果实挥发性物质的含量。SWCF处理为绿色高效改善柑橘果实外观品质提供了新思路。     

‘Cocktail’葡萄柚黄龙病菌检测及鉴定

采用直接组织免疫印迹(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)和常规PCR技术,对采自广东梅州新建‘Cocktail’葡萄柚园内表现疑似黄龙病症状的样品进行检测。DTBIA检测发现疑似样品的韧皮部存在特征性紫红色反应,与黄龙病阳性对照反应一致。PCR检测发现枝条、叶片和果实样品中均检测出了黄龙病菌特异性条带,其中果蒂、中柱和种皮内病菌含量较高。进一步测序分析发现,来自‘Cocktail’葡萄柚病样的16Sr DNA和ef Tu基因与NCBI中的柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)对应基因的序列相似性均为100%,证实‘Cocktail’葡萄柚感染了柑橘黄龙病菌亚洲菌株。     

柑橘黄龙病病原菌Las在叶圆片嫁接接种的‘锦橙’中早期扩散研究

为了探究黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）病原菌在柑橘韧皮部的早期运动情况,以柑橘黄龙病亚洲致病种Candidatus Liberibacter asiaticus（Las）为毒源,黄龙病高感品种‘锦橙’实生苗为受体材料进行叶圆片嫁接传毒。利用定量PCR技术对嫁接口处近端主脉、远端主脉、叶柄以及缘周叶组织进行了为期84 d的菌量测定。结果发现,病原菌在近端主脉中积累最快,其次是远端主脉、叶柄和缘周叶组织。以近端主脉为原初侵染部位,Las在嫁接叶片中1 ~ 84 d的早期运动可分为潜伏期（1 ~ 42 d）、指数期（43 ~ 70 d）和稳定期（71 ~ 84 d）。在早期侵染过程中,Las病原菌主要沿叶主脉从原初侵染部位由近向远扩散,其扩散趋势与症状从原初侵染部位向外扩散紧密相关。证实叶圆片嫁接法可作为柑橘HLB一种有效的传毒方式。     

柑橘新品种——少核红橙

柑橘品种红江橙以其果实橙红色、果肉深橙红色、风味浓郁、品质优良而深受国内外消费者欢迎。但是．红江橙果实平均单果种子多达18粒．而国际市场上畅销的橙果大部分都是少籽、无籽（例如脐橙、夏橙等）。如果不改良红江橙单果种子多的缺点．就很难进一步提高该品种市场竞争力。     

木质素生物合成途径相关基因调控琯溪蜜柚汁胞粒化的研究

【目的】探究琯溪蜜柚果实汁胞粒化过程中木质素生物合成途径相关基因在果实发育过程中的表达特征，以揭示汁胞粒化过程中木质素合成的分子调控机制。【方法】选取2018年花后135、165、195、215 d 4个时期的琯溪蜜柚果实，测定汁胞粒化率及木质素含量以及分析转录组数据筛选到的木质素生物合成途径关键基因的差异表达和相关酶活性变化，并进行汁胞细胞壁木质素沉积的显微观察。【结果】在琯溪蜜柚花后195至215 d果实发育成熟期，木质素生物合成途径中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2和CrPOD7等9个基因的表达量都显著增强，qRT-PCR验证结果与转录组数据一致。这期间果实汁胞粒化明显加速，木质素合成相关酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）、过氧化物酶（POD）的活性明显上升，木质素含量显著积累，番红染色显示木质素在蜜柚汁胞细胞壁中明显沉积。【结论】琯溪蜜柚木质素生物合成途径相关基因参与调控汁胞粒化过程中细胞壁木质素的合成。研究结果为今后琯溪...     

不同品种柑橘系统重金属富集特征研究

为探讨不同品种柑橘系统重金属富集特征,按照植物样重金属元素的测定方法,分析贵州红水河、南盘江、清水江、都柳江等沿岸椪柑、脐橙、南丰等3个品种的叶片、果实中的铬、镍、铜、锌、镉、铅、砷、汞的富集量。结果表明,椪柑、脐橙、南丰叶片中重金属的富集能力大小顺序都相同,即:ZnCuNiCrPbAsHgCd,果肉富集能力大小顺序略有差异。柑橘不同品种的重金属富集量有较大的差异。说明同一品种对不同的重金属富集量明显不同,不同部位的重金属富集量有较大的差异,总体趋势是叶片大于果实;不同品种对重金属的富集量也明显不同。调查结果表明,研究区域柑橘园适合发展无公害果品生产。     

每州金柚黄龙病发生情况及防控对策建议

梅州金柚（沙田柚）是梅州农业的名片，全市现有栽培面积1．83万hm^2,总产26．99万t，金柚生产已成为梅州市农业主导产业和农民脱贫致富奔小康的重要途径。但是，随着金柚生产的发展，近年来梅州市金柚主产区陆续发生了柑橘黄龙病为害，并存在进一步蔓延扩散的可能，对金柚产业的发展和稳定造成严重的威胁。为进一步摸清梅州金柚黄龙病的发生分布和为害情况，确保梅州市金柚产业持续健康安全发展，2010年冬2011年春梅州市集中力量开展了金柚黄龙病普查工作，笔者根据普查结果进行研究与分析，提出了梅州金柚黄龙病防控对策建议。