广西大王岭和大明山自然保护区苏云金芽孢杆菌收集与鉴定

从广西大王岭和大明山两个自然保护区共采集到土样264份，共分离出597株芽孢杆菌，通过光学和电子显微镜检观察，16株分离株观察到伴胞晶体蛋白，初步确定为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），出菌率为6．06％。在16株肪分离株中，有4株在芽孢形成过程中能产菱形晶体蛋白，其余12株能产圆形和其他形状的晶体蛋白。利用PCR—RFLP方法和SDS．PAGE方法对16株助分离菌进行了蛋白和基因型的鉴定，结果表明，16株分离株中含有4株crylAc基因，表达约130kD的晶体蛋白，其中含有cry30基因和cry40基因的菌株分别1株和3株，表达大约75kD的晶体蛋白；另外8株戤菌株表达蛋白大小不一，其基因型尚不能确定，有待进一步分析。生物测定表明，产菱形晶体含有crylAc基因的4株励分离株对鳞翅目小菜夜蛾幼虫有很强的毒杀活性，而其它分离株对小菜夜蛾没有毒杀活性。     

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定。从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03％和8.40％。结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900m至1400m的反菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带眈菌株含量最高。显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状。利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20kD到150kD不等。进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型。我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性。整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源。     

苏云金芽孢杆菌S1478—1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的＆菌株S1478～1进行了特性鉴定,研究表明S1478—1分离株菌落形态和生长特征和励参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478—1分离株与其它＆thuringiensis、B．cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99％。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478—1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5．159×10^8cfu／mL。初步显示S1478—1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR—RFLP方法鉴定S1478—1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133．3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99％同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

煤矿中苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的分离及其鉴定

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt,光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析,利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry,2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明,分离菌含有cry1基因型,经克隆、测序后可知,菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 k D,通过蛋白质谱分析表明,杀虫蛋白为Cry1Ac,与PCR-RFLP所得出的结果一致;通过质谱分析还鉴定出分子伴侣Gro EL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明,这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换,以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌,为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。     

苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达*

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定。它含有cry1Ac基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac。该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3534bp。编码蛋白分子量为133.5kD,含1177个氨基酸,等电点为4．8,与CrylAc3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同。该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133．5kD蛋白带。室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC5o值分别为19.236和3276μg／g饲料。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa14基因的分离、克隆及其表达

Bt25是中国自行分离的对小菜蛾(Plutella xylotella)具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),经PCR-RFLP鉴定含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,以Bt25质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因。序列测定结果表明,该基因编码区为3552bp,编码1183个氨基酸,分子量为133．7kD,pI4．755。该基因序列已在GenBank注册,登记号为AY197341,并获得正式命名cry1Aa14。在氨基酸序列918～1180间,和已知的11种cry1Aa存在22-23个氨基酸的差异(其中1094～1097的4个氨基酸无对应序列),而这段区域和Cry1Ab氨基酸序列的对应区域无差异。cry1Aa14全长基因插入Bt表达载体,获得了重组表达质粒pBYB1,转化Bt无晶体突变株HD73cry-,经过抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实转化成功。SDS-PAGE分析表明,该基因在上述受体中能正常表达133kD蛋白。杀虫生物测定结果表明,cry1Aa14表达产物对小菜蛾幼虫具有显著的毒杀作用,与cry1Aa12进行比较,毒力无明显差异。这种单基因菌株的发现及其基因的获得,为害虫抗性研究和高效工程菌的构建提供了重要实验材料。     

酒糟和窖泥中苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

从泸州老窖酒厂的酒糟和窖泥中采集的168个样品中分离出苏云金芽孢杆菌1株,经光学显微镜观察伴孢晶体形态为菱形。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry5、cry6、cry8、cry4/10、cry11、cry1Ⅰ的引物做PCR分析进行基因型鉴定,发现该分离株有cry1基因。同时还对该株蛋白质图谱和杀虫活性等特性分析,结果表明该分离株对小菜蛾有一定活性,死亡率可达80%,但该菌株对致倦库蚊无活性。     

基于Illumina测序技术挖掘Bt杀虫基因资源

苏云金芽孢杆菌作为应用最为广泛的生物农药,已经成为化学合成农药必要的补充或替代品,其杀虫蛋白基因已成功的应用到转基因抗虫作物中。本文基于海南五指山和吊罗山热带原始雨林区土壤样品筛选分离的Bt菌株资源,利用第二代测序技术Illumina对分离的特异Bt菌株的杀虫基因进行全面分析,鉴定出新型Bt杀虫蛋白基因25个,其中包括5个新型的营养期杀虫蛋白基因（vip）和3个新型cyt基因。本研究表明第二代DNA测序技术可以高效用于挖掘Bt杀虫基因资源,而获得的新型杀虫蛋白基因将进一步丰富我国能够应用的杀虫基因种类。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

苏云金芽孢杆菌WB9菌株cry2Ac4基因的克隆及表达

WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株,经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。根据cry2基因序列设计引物,以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。该基因在GenBank上登录号为DQ361267,被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ac4。通过亚克隆方法将cry2Ac4基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac,将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-,得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白,形成方形晶体。生物测定结果表明,cry2Ac4基因表达产物对桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)幼虫具有显著的毒杀作用,但对小菜蛾(Plutella xylostella)和致倦库蚊(Culex fatlgans)幼虫基本没有效果。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

苏云金芽胞杆菌Bt9875杀虫晶体蛋白可诱导Caspase和Bcl-2家族参与调控HL-60细胞凋亡

研究Caspase家族与Bcl-2家族参与调控苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt9875杀虫晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响.本实验采用MTT法检测了杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡后的Caspase家族的活性和Caspase凋亡酶抑制剂对杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡的影响;采用Western blot检测了杀虫晶体蛋白诱导多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)降解、Bcl-2/Bax调控和细胞色素C的释放.研究结果表明,杀虫晶体蛋白作用HL-60细胞后,激活了Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,在48 h内Caspase家族抑制剂(Z-VAD-FMK)、Caspase-3抑制剂(z-DEVD-FMK)和Caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)均可显著抑制杀虫晶体蛋白诱导的细胞凋亡;杀虫晶体蛋白可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时下调抗凋亡蛋白BCl-2的表达,并观察到胞浆中细胞色素C的释放.初步证明了Bt9875杀虫晶体蛋白诱导的HL-60细胞凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同调控的,线粒体途径在诱导细胞凋亡过程中起着重要作用.     

苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选

本研究建立了一套利用苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫的生物测定方法。通过该方法从本实验室收集保藏的苏云金芽胞杆菌菌株中筛选出了对植物寄生线虫有毒杀作用的菌株11株。通过复筛确定了10个菌株的伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫有活性；SDS-PAGE显示这些菌株的伴胞晶体蛋白组成具有特异性和多样性。其中菌株YBT-021的杀线虫其半致死浓度（LC50）分别为：北方根结线虫(Meloidogyne hapla) 35.62μg/mL，苎麻短体线虫(Pratylenchus scribneri) 75.65μg/mL，苎麻矮化线虫（Tylenchornchus sp.）94.31μg/mL，甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor) 215.21μg/mL。     

Biomimetic extraction of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins from soil based on invertebrate gut fluid chemistry

Quantitative monitoring of Bacillus thuringiensis (Bt) insecticidal crystal proteins in soil has been hampered by the lack of efficient extraction/detection methods. A novel approach for simple and effective Bt protein extraction was explored by evaluating extraction solutions from invertebrate gut fluids. Marine worm gut fluids were identified as promising for extracting Bt protein from soil. An artificial gut fluid based on these marine worm gut fluids was developed using commercially available chemicals and was evaluated for its ability to extract Bt proteins from soil. On the basis of experiments with Cry1 proteins, the artificial gut fluid in combination with ELISA was highly effective for protein extraction and analysis in a variety of soil types and was well-correlated with bioassay results. Coupling of immunoassay with this extraction method provides, for the first time, an efficient, accurate, and quantitative assay for routine measurement of Bt protein residues in soil.     

Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production

Bacillus thuringiensis is indistinguishable from Bacillus cereus except for the production of insecticidal crystal proteins (ICPs). B. thuringiensis strains may show enterotoxin profiles and toxin levels similar to those of B. cereus strains isolated from food-poisoning cases. It is important for the food industry and farmers to consider that with the application of B. thuringiensis strains to crops, their spores may be introduced into the human food chain. In this study, 59 B. thuringiensis strains were assayed for their hemolysin BL (HBL) using a BCET-RPLA kit and their cytotoxicity to Chinese hamster ovary (CHO) cells. The enterotoxin titer was as high as that of B. cereus diarrheal-type strain ATCC 49064. In an attempt to obtain a food safety strain for bioinsecticide use, in this study, a 3.5-kb cry1Ac DNA fragment was amplified with PCR from the total DNA of B. thuringiensis subsp. kurstaki CCRC 11502 and cloned into the Bacillus expression vector pHY300PLK. The alpha-amylase promoter, amyE, was then introduced into the promoter region and, afterward, the recombinant plasmid pHYe1Ac35 was introduced into a non-enterotoxigenic and non-cytotoxic B. thuringiensis subsp. kurstaki Tt14 strain. The transformant, without any detectable enterotoxigenicity or cytotoxicity, produced Cry1Ac toxin properly, and its insecticidal activity against Trichoplusia ni larvae was found to be satisfactory.