胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥;转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥,而Na+含量较野生型拟南芥低。100mmol/L NaCl处理后,转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2,并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响,用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI(抑制H2O2的产生)处理后,转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱,Na+外流和H+内流增强,植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生,维持了SOS1mRNA的稳定性,调控了K+和Na+平衡,并激活了抗氧化防御系统,因而显著提高了其耐盐性。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

胡杨PeREM6.5调控拟南芥水分胁迫耐受机制

  目的  Remorin蛋白是广泛存在于苔藓、裸子和被子植物中的蛋白家族,在调控植物生长发育及生物胁迫反应方面具有重要作用,但有关remorin抵御非生物胁迫作用机制的研究较少。前期研究发现抗逆树种胡杨的remorin 6.5（REM6.5）可通过增强质膜质子泵活性提高植物耐盐性,在此基础上,本文研究了胡杨PeREM6.5在植物耐受水分胁迫中的作用,旨在进一步揭示植物抗旱的生理与分子机制。  方法  以过表达PeREM6.5拟南芥（OE1和OE2）、野生型（WT）和转空载体对照（VC）拟南芥为试验材料,对各基因型拟南芥进行水分胁迫处理（包括渗透胁迫和土壤干旱）以及复水处理,从生理生化及分子生物学角度研究了胡杨PeREM6.5在拟南芥干旱胁迫中的响应机制。  结果  甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥的存活率、根长显著高于WT和VC,并且在渗透胁迫下细胞膜受损程度较小,这些表型差异主要与转基因拟南芥水分吸收、抗氧化防御能力增强有关。甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥水通道基因AtPIP1;2和AtPIP2;1的表达量提高。甘露醇处理诱导WT和VC根细胞积累H₂O₂,对细胞膜造成氧化伤害。转基因株系在甘露醇处理后过氧化物酶基因POD和过氧化氢酶基因CAT表达量显著上调,能维持较高的POD和CAT酶活性,清除H₂O₂及其对细胞膜造成的损伤。在土壤干旱处理9 d后,转基因株系的叶绿素含量下降幅度低于WT和VC,复水后叶绿素含量恢复程度较高。另外,PeREM6.5转基因株系在干旱胁迫下维持PSⅡ实际光合量子产量的能力增强。  结论  过表达胡杨PeREM6.5基因提高了拟南芥对水分胁迫的耐受性。      

胞外ATP、H2O2、Ca2+与NO调控木榄根系离子平衡机理研究

运用非损伤微测技术(NMT),研究了短期盐胁迫下胞外ATP(eATP)、H2 O2 、Ca2 + 与NO 对非泌盐红树木榄根 系K+/Na+ 平衡的调控作用。NaCl(100 mmol/L,24 h)与等渗甘露醇处理的实验表明,木榄根尖对盐胁迫的响应具 有高度的离子特异性。盐胁迫增强了木榄根尖的Na+ 外流,但Na+ 外流被Na+ /H+ 逆向转运蛋白抑制剂Amiloride 和质膜H+ -ATPase 抑制剂Vanadate 抑制,表明Na+ 外流源于根尖表皮细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运系统驱动的Na+ 外排。短期盐胁迫处理能诱导木榄根尖K+ 外流,但被氯化四乙胺(TEA,外向K+ 通道抑制剂)明显抑制,证明K+ 外流是由激活的去极化外向型离子通道KORCs 介导。胞外ATP(300 mol/L)、H2 O2 (10 mmol/L)、Ca2 + (10 mmol/ L)与SNP(NO 供体,100 mol/L)均能增加短期盐胁迫下的Na+ 外流,同时抑制K+ 外流。其中,促进Na+ 外流效果 较强的是H2 O2 和Ca2 + ,而Ca2 + 和NO 抑制K+ 外流的效果突出。这些实验结果表明,胞外ATP、H2 O2 、Ca2 + 与NO 这4 种盐胁迫信使是通过上调木榄根系细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运体系(Na+ /H+ 逆向转运体和H+ 泵)活性,在促 进Na+ 和H+ 逆向跨膜转运的同时,抑制去极化激活的K+ 离子通道来减少盐诱导的K+ 外流。      

渗透胁迫调节基因--Na+/H+ Antiporter基因与植物耐盐性

Na+/H+ Antiporter基因与植物耐盐性密切相关,其编码产物Na+/H+逆向转运蛋白通过Na+ 外排和Na+ 区隔化来维持植物细胞内较低的Na+ 水平,降低Na+的毒害,从而对植物的耐盐性起重要作用.     

转Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（PeNhaD1）基因派间杂种110杨的获得

胡杨Na+/H+逆向转运蛋白基因(PeNhaD1)编码一种质膜Na+/H+逆向转运蛋白,在胡杨细胞拒盐机制中具有重要作用.本研究利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)介导的叶盘法将PeNhaD1基因转入盐敏感且速生的派间杂种110杨(P.deltoidesX P.maximozoiczi‘Eridano')中.经PCR和PCR-Southern检测已获得转PeNhaD1基因的110杨再生植株.     

胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制

目的盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1.3的编码基因PeREM1.3,并研究PeREM1.3基因在植物耐盐性中的作用。方法笔者将基因构件35S::PeREM1.3转入模式植物烟草中, 在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1.3的转基因烟草进行基因功能的分析。结果研究显示PeREM1.3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1.3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1.3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1.3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1.3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAK、NHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K+/Na+平衡。结论这些结果说明PeREM1.3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K+/Na+平衡来提高植物的耐盐性。      

獐茅耐盐基因SOS1的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RLM-RACE方法从单子叶盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AlSOS1,JN936862),并对其基因序列进行了分析。Southern杂交试验显示:AlSOS1基因在獐茅基因组中以单拷贝形式存在。AlSOS1基因cDNA全长3 641bp,其中编码区3 420bp,编码一个1 139氨基酸的蛋白。AlSOS1编码蛋白与芦苇、水稻质膜Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系最为接近,达到82%和77%,与双子叶植物拟南芥的亲缘关系仅为58%;系统发育分析显示AlSOS1基因编码蛋白与其他植物质膜型Na+/H+逆向转运蛋白属于同一分支,而与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白属于不同的分支;疏水性分析显示AlSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。这是獐茅SOS1基因编码区首次被完整克隆,将进一步应用于单子叶农作物耐盐性状改良的基因工程之中。     

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PsnhaA的克隆及在大豆中的功能验证

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。为促进作物的遗传转化,选育耐盐作物品种,从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PsnhaA,并构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导的整株生长点注射法转化大豆。结果表明:PsnhaA基因已整合到转化大豆基因组中,并在转录水平获得表达。耐盐相关生理指标检测结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。PsnhaA基因显著提高了大豆的耐盐水平,为农作物的耐盐性改良提供了优良的候选基因。     

过表达胡杨PePKS5提高拟南芥耐盐性

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分,在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上,探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因,并在拟南芥中过表达,获得T₃代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型,测定其过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na⁺、K⁺动态离子流,利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na⁺和H₂O₂含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标,揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体,通过瞬时转化烟草,对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】(1)PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸,PePKS5氨基酸序列与...     

胡杨PeAPY1和PeAPY2调控拟南芥耐盐机制研究

本文研究了胡杨apyrase基因(PeAPY1和PeAPY2)对植物耐盐性的影响。以PeAPY1和PeAPY2过表达拟南芥、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、野生型(WT)拟南芥及空载体(VC)为实验材料,研究盐胁迫条件下的植物根长、相对电导率、细胞活力、H₂O₂水平、eATP浓度、抗氧化酶活性的变化。研究结果显示:低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对拟南芥各基因型的生长和生理生化指标没有显著影响;而高盐浓度(100 mmol/L NaCl)抑制了各株系的根长生长、细胞活力和抗氧化酶(超氧化物歧化酶/SOD、抗坏血酸过氧化酶/APX、过氧化氢酶/CAT)活性,却提高了相对电导率、H₂O₂水平和eATP浓度。但与Atapy突变体株系相比较,PeAPY过表达株系受高盐胁迫的影响较小。主要是由于PeAPY1/2的过表达提高了apyrase酶活,下调了eATP浓度及其诱发的活性氧水平,同时,过表达株系还通过保持抗氧化酶活性来抑制H₂O₂的水平,从而降低活性氧及其对膜脂的过氧化,保持了膜的稳定性、细胞活力和生长,最终提高了植物耐盐性。      

野大麦耐盐适应性反应机制的研究

【目的】探讨野大麦的耐盐适应性反应机制。【方法】采用原子吸收和X-ray微区分析等方法分析野大麦[Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link]在NaCl胁迫下幼苗生长、K+和Na+吸收、运输、分配及外排等生理响应。【结果】在NaCl≤350 mmol•L-1时，茎叶和根系的干重变化不明显，盐浓度的增加对根生长的抑制作用小于茎叶，根Na+含量增加的幅度小于茎叶、茎叶和根中K+含量均下降，但茎叶可维持较高的K+含量；野大麦具有较强的K+-Na+吸收选择性；低盐胁迫时Na+主要贮存于液泡和细胞间质；高盐胁迫时主要通过外排Na+来维持体内离子平衡。【结论】野大麦在NaCl≤350mmol•L-1时生长正常，其耐盐性与根拒绝吸收Na+及茎叶维持高K+含量有关，Na+区域化与外排可能是野大麦主要的耐盐适应性反应机制。     

盐度胁迫对锯缘青蟹体内腺苷三磷酸酶和磷酸酶活性的影响

采用酶学分析的方法研究了盐度（分别为5、15、25、35）胁迫下锯缘青蟹鳃、肌肉和肝胰腺中腺苷三磷酸酶和磷酸酶活性变化。结果表明，随着盐度降低，青蟹鳃中Na^＋，K^＋-ATPase、Ca^2＋，Mg^2＋-ATPase活性均升高，随着胁迫时间延长，Na^＋，K^＋-ATPase活性呈现不同的变化规律，且趋于平缓。青蟹肌肉中ACP活性随着盐度的升高而呈小幅度下降，而肝胰腺中ACP活性则呈小幅度升高，但各组之间差异不显著（P〉0.05）。不同胁迫时间同一盐度组青蟹肌肉中的ACP活性有升有降。青蟹肌肉、肝胰腺中AKP活性随着盐度升高而升高;随着胁迫时间延长，同一盐度组青蟹肌肉中AKP活性均呈升高趋势，肝胰腺中AKP活性有升有降。由此可见，盐度对青蟹生理生化影响显著。     

石榴耐盐性研究与指标筛选

以3个石榴Punica granatum品种的扦插苗为材料,研究不同浓度（0,150,300,450 mmol·L-1）氯化钠胁迫对各品种生长和生理生化指标的影响,并筛选适合评价石榴耐盐性的指标。结果表明:与对照相比,‘红珍珠’ ‘Hongzhenzhu’的生物量随氯化钠浓度升高而降低,而低盐胁迫（150 mmol·L-1）下,‘泰山红’ ‘Taishanhong’和‘超大籽’ ‘Chaodazi’的生物量增加。随着盐浓度增大,各石榴品种盐害加重;单位质量新鲜叶片中叶绿素质量分数降低;脯氨酸质量分数、丙二醛质量摩尔浓度、钠离子质量分数升高;可溶性蛋白质质量分数先降低后升高;超氧化歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）酶活性和钾离子质量分数先升高后降低,300 mmol·L-1处达到最大值;氯化钠浓度不超过300 mmol·L-1时,钾钠离子比均大于1。研究说明:石榴能够抵抗中度盐胁迫（≤ 300 mmol·L-1）,主要通过增加脯氨酸、钾离子等渗调物质质量分数和提高抗氧化酶活性来缓解盐害。灰色关联分析筛选出单株生物量、SOD酶活性、盐害指数、钾钠离子比值和丙二醛质量摩尔浓度作为评价石榴耐盐性的主要指标。     

alpha-Klotho as a regulator of calcium homeostasis

alpha-klotho was identified as a gene associated with premature aging-like phenotypes characterized by short lifespan. In mice, we found the molecular association of alpha-Klotho (alpha-Kl) and Na+,K+-adenosine triphosphatase (Na+,K+-ATPase) and provide evidence for an increase of abundance of Na+,K+-ATPase at the plasma membrane. Low concentrations of extracellular free calcium ([Ca2+]e) rapidly induce regulated parathyroid hormone (PTH) secretion in an alpha-Kl- and Na+,K+-ATPase-dependent manner. The increased Na+ gradient created by Na+,K+-ATPase activity might drive the transepithelial transport of Ca2+ in cooperation with ion channels and transporters in the choroid plexus and the kidney. Our findings reveal fundamental roles of alpha-Kl in the regulation of calcium metabolism.     

K~+,Ca~(2+)和Mg~(2+)对不同水稻(Oryza sativa L.)基因型苗期耐盐性的影响

【目的】进一步探明盐胁迫条件下营养元素K+、Ca2+和Mg2+对苗期不同水稻基因型耐盐性的影响差异,为明确作物耐盐胁迫的生理机制、提高作物耐盐胁迫能力提供参考。【方法】于2009年1—4月在严格控制水、温、光和营养元素供应的国际水稻研究所人工气候室进行水培试验,比较研究营养液中K+、Ca2+和Mg2+浓度的变化对不同水稻基因型苗期耐盐性的影响。【结果】在盐胁迫条件下(100mmol·L-1NaCl),耐盐基因型(FL478和IR651)与盐敏感基因型(IR29和Azucena)相比,植株体内有较低的Na+含量和Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比,有较高的K+含量,这些都是耐盐基因型耐盐胁迫能力高于盐敏感基因型的内在原因。盐胁迫条件下提高营养液中Ca2+和Mg2+的含量(60mg·L-1),可显著降低植株体Na+含量和Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比,明显减轻盐胁迫的危害,增强水稻耐盐胁迫能力,且Ca2+处理的效果优于Mg2+处理;而提高营养液K+含量对以上指标的影响远远小于Ca2+处理和Mg2+处理,这也是K+处理对水稻耐盐性影响相对不明显的内在原因。【结论】K+、Ca2+和Mg2+在植株体内的含量及其与Na+的比值变化都会影响水稻苗期耐盐性;适当提高水稻生长环境的Ca2+和Mg2+浓度可以明显增强植株耐盐胁迫能力,营养元素Ca2+的效果比Mg2+明显;而K+对水稻耐盐性的影响相对不明显。     

K+及主要离子间交互作用对凡纳滨对虾存活、生长及体内ATP酶的影响

采取L16(215)正交设计试验,开展5周凡纳滨对虾养殖试验,分析养殖水体中K+及K+、盐度、Ca2+、Mg2+四因子间交互作用对凡纳滨对虾存活、生长及体内ATP酶的影响。结果表明:K+对凡纳滨对虾成活率、体长和体重增加及体内ATP酶活性均具有显著影响,K+浓度为150 mg/L时成活率最高,而K+浓度为50 mg/L时生长速度最快,Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活也最高;K+、盐度、Ca2+、Mg2+四因子间交互作用对凡纳滨对虾存活、生长及体内ATP酶也具有显著影响。本试验因素水平组合中凡纳滨对虾成活率的最佳组合为盐度15、K+150 mg/L、Ca2+100 mg/L、Mg2+300 mg/L,生长速度的最佳组合为盐度15、K+50 mg/L、Ca2+100 mg/L、Mg2+100 mg/L,凡纳滨对虾体内Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活的最佳组合为盐度5、K+50 mg/L、Ca2+100 mg/L、Mg2+100 mg/L。