转双价双Bt基因(Cry1Ac+Cry2Ab)抗虫棉栽培地生存竞争能力研究

为建立国家转双价双Bt抗虫基因棉环境安全评价技术,对转双价双Bt基因(Cry1Ac+Cry2Ab)抗虫棉栽培地生存竞争能力进行研究,结果表明,转双价双Bt基因棉花与对照赣棉11相比,各生育期株高生长具有显著竞争优势,优势值3.48～4.75 cm;吐絮期棉覆盖度竞争优势超对照46.77个百分点,达显著水平;产量竞争力优势籽棉超对照1 013.85 kg/hm2,皮棉超对照433.20 kg/hm2,均未达到显著水平;发芽率竞争优势极显著,超过对照2.75个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价双Bt抗虫基因棉生存竞争能力优势显著。     

Study on Survival Competitive Ability of Transgenic Cotton Harboring CrylAc＋Cry2Ab Double Bt Genes in Cultivated Field

为建立国家转双价双Bt抗虫基因棉环境安全评价技术,对转双价双Bt基因（Cry1Ac＋Cry2Ab）抗虫棉栽培地生存竞争能力进行研究,结果表明,转双价双Bt基因棉花与对照赣棉11相比,各生育期株高生长具有显著竞争优势,优势值3.48～4.75 cm;吐絮期棉覆盖度竞争优势超对照46.77个百分点,达显著水平;产量竞争力优势籽棉超对照1 013.85 kg/hm2,皮棉超对照433.20 kg/hm2,均未达到显著水平;发芽率竞争优势极显著,超过对照2.75个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价双Bt抗虫基因棉生存竞争能力优势显著。     

转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的检测技术与生存竞争能力研究——基于草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下

此研究为国家转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉环境安全评价技术建立而设。在草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下的检测技术,以杂交抗虫棉赣棉杂1号和非转基因棉赣棉11号为2个对照,来检测评价转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的生存竞争能力。结果:转Cry1Ac+EPSPS棉与两个对照相比不显示抗虫优势;株高增长无竞争力;覆盖度有不显著的弱竞争力;单株成铃、单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分率、脱落率、籽棉产量、皮棉产量与赣棉杂1号比呈现显著或极显著的负竞争优势,与赣棉11号比无竞争优势;果枝层数前期与两对照相比有极显著的负竞争优势,后期与赣棉杂1号比无竞争优势,与赣棉11号比有显著的负竞争优势。结论:转Cry1Ac+EPSPS棉推广种植可行性较差。本项检测技术和评价方法有较好的适用性。     

2种新的转双价基因棉种子越冬能力研究

以非转基因常规棉赣棉11号为对照,用当年的种子进行年前与年后室内发芽试验,研究转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉和转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉种子的越冬能力,结果表明:室内常温越冬后,转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉的发芽势及发芽率并未衰减,反而有所增强,分别提高0.75和1.00个百分点,转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的发芽势及发芽率都提高1.00个百分点;而常规棉(CK)的发芽势及发芽率分别衰减2.75和1.00个百分点,这说明转双价抗虫基因棉及转双价抗虫抗除草剂基因棉种子的越冬竞争能力较强。此外,3个供试棉花品种的种子野外越冬均不能发芽和生苗,野外播种无越冬能力。     

转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉与非转基因棉生物学特性差异的研究

以双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉为观察品种,非转基因棉赣棉11号为对照品种,进行了棉花生育性状、产量性状等的比较和评价研究。结果表明:与对照品种相比,双价抗虫抗除草剂基因棉在成铃至吐絮期株高增长显著(超速6.6～9.1 cm);在盛铃期之前成铃变缓极显著(少10.7个铃);花铃期至盛铃期果枝层生成慢显著(少1层);果枝角度变大极显著(大2.1°);主茎节距拉长极显著(长0.6 cm);叶色加深显著;衣分率降低极显著(低1.7%);籽指升高极显著(高1.77 g);纤维整齐度指数升高显著(高1.325%);纺纱均匀指数增加显著(增7.5);籽棉、皮棉、霜前籽棉、霜前皮棉均减产极显著。初步评价:双价抗虫抗除草剂基因棉的生育性状、产量性状较差,纤维纺纱性状较好,推广种植性较差。     

转双价抗虫抗除草剂基因棉栽培地生存竞争能力研究

此研究为国家转双价抗虫抗除草剂棉花环境安全评价技术建立而设。结果：转双价抗虫抗除草剂基因棉在吐絮期株高生长竞争优势达显著水平,超对照9.12 cm;吐絮期棉花覆盖度竞争优势达极显著水平,超对照100.5个百分点;产量竞争优势不显著,籽棉超对照66.92 kg/亩,皮棉超对照21.14 kg/亩;发芽率无竞争优势,低于对照0.5个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价抗虫抗除草剂基因棉总体上生存竞争能力具有优势。     

自然昆虫传粉转Bt基因棉花核质不育系的主要性状研究

研究了昆虫自然传粉条件下转Bt基因棉、常规棉核质不育系及其相应同核异质保持系的主要经济性状。结果表明 :不育系的单株成铃、衣分、霜前籽棉和皮棉产量极显著低于保持系 ,子指显著高于保持系 ;转Bt基因不育系的单铃重显著低于保持系 ,霜前种子产量差异不明显 ;转Bt基因不育系霜前种子产量极显著高于常规不育系 ;转Bt基因不育系昆虫自然授粉率比常规不育系大幅提高。     

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。     

陆地棉Bt抗虫基因类型鉴定与染色体定位

为明确Bt抗虫棉种质系N099的抗虫性状遗传方式、抗虫基因类型以及抗虫基因插入染色体的位置,用N099为父本与非抗虫海岛棉海7124杂交,分析了F2分离世代遗传方式,结果表明该抗虫棉的抗虫性状呈简单的1对显性基因控制的质量遗传方式。进一步在Bt毒蛋白和DNA 2个层面对该抗虫基因类型进行鉴定,结果显示N099所含抗虫基因为双价Bt基因Cry1Ac+Cry2A。而后利用234对核心引物对F2代抗、感株组成的近等基因混池进行多态性筛选,发现其中1对多态性引物NAU2912与该Bt基因连锁。已知引物NAU2912位于棉花第26染色体上,通过对该引物上、下50.0 c M之间的其他引物进行多态性筛选,共获得16对引物与双价Bt基因相连锁,目的基因位于分子标记dc40260和cgr6702之间,其遗传距离分别为1.8 c M和2.9 c M,因此将双价Bt基因定位在棉花第26染色体上。     

新疆转Bt基因棉主要性状的配合力和杂种优势分析

[目的]新疆是我国最大的棉花种植基地.转Bt基因抗虫棉能有效抵御棉铃虫灾害,其面积在新疆日益扩大.分析新疆自育陆地棉和转Bt基因抗虫棉的配合力和杂种优势可为快速、有效培育出适应新疆的高产、优质抗虫棉奠定基础.[方法]以6个转Bt基因抗虫棉品种(系)和11个不同来源的常规陆地棉品种(系)为亲本,按照11×6的NCⅡ设计组配不完全双列杂交,得到66个杂交组合,分析杂交组合10个主要性状的配合力及遗传效应和杂种优势表现.[结果]同一亲本各性状间和同一性状不同亲本间的一般配合力效应值不同.[结论]母本A7(丰凯2002)和A10(石K14)在皮棉产量、籽棉产量上具有较高的一般配合力效应值,是较好的丰产品种;父本B5(15-80K)和B3(15-52K)在长度、比强度上具有较高的GCA效应值,是较好的品质品种;组合A9×B2(三棉9号×石抗126)、A10×B4(石K14×112-17K)、A11×B2(66-9×石抗126)、A8×B6(H10-2×16-9K)、A9×B1(三棉9号×金惠2号)和A1×B6(FY11×16-9K)具有高产、优质的潜力;竞争优势分析发现籽棉产量、皮棉产量、单铃重、衣分、长度、整齐度和伸长率7个性状的竞争优势均为正向,其中以皮棉产量和籽棉产量的竞争优势最大,分别达到了14.84％和16.46％.     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

转基因植物中Bt Cry2Ab蛋白的抗原表位特征预测

[目的]通过生物信息学方法了解转基因作物中Bt Cry2Ab蛋白的二级结构、三级结构、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位等结构特征,为今后的抗体设计奠定基础。[方法]以在NCBI数据库中获得Cry2Ab蛋白序列为材料,应用DNAStar中的多种方法预测其B细胞表位,并通过在线预测软件NetMHCII 2.2分析Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子的结合能力,从而预测其T细胞抗原表位。[结果]对Cry2Ab蛋白B细胞抗原表位的预测表明,Cry2Ab蛋白的第208～215区域是潜在的B细胞抗原表位;对Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子结合能力的分析表明,Cry2Ab蛋白的第177～185区域、299～307区域和255～263区域是潜在的T细胞抗原表位,暗示含有HLA-DRB10101和HLA-DRB10701等位基因的人群对Cry2Ab蛋白更敏感。[结论]该研究有助于深入了解Cry2Ab蛋白的生物学特征,为完善转基因食品过敏原性的评估方法提供新线索。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析

利用已克隆的5种Bt Cry基因Cry2Ab4、Cry1Ia8、Cry1Ie1、Cry1Ca7、Cry1Cb2和1种野生菌株HD-73(Cry1Ac)表达的6种Bt Cry杀虫晶体蛋白,对棉铃虫进行生物活性分析,并将Cry1Ac杀虫晶体蛋白分别与其它5种Cry蛋白按1:1的比例组合,对棉铃虫进行生物活性测定。结果表明,单独使用Cry1Ac时对棉铃虫活性最高,LC50为3.16μg·mL-1,其次为Cry2Ab4。Cry1Ac与Cry2Ab4组合对棉铃虫也有较高的活性,LC50为48.70μg·mL-1,该组合对棉铃虫的共毒系数为1.21,有相加作用。Cry1Ac与这5种蛋白的组合对棉铃虫都有较高的毒力。     

昼夜变温下高温与干旱胁迫对Bt棉毒蛋白含量的影响及其生理机制

【目的】明确Bt棉叶片Cry1Ac毒蛋白含量对昼夜变温下高温干旱胁迫响应及其生理机制,为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供参考。【方法】2019—2020年在扬州大学农学院,以常规种泗抗1号（SK-1）和杂交种泗抗3号（SK-3）为材料,以温度和土壤水分含量为因子,温度分别设为34℃（白天,7:00—19:00）/28℃（夜间,19:00—7:00）(A1)、38℃/28℃（A2）;土壤水分含量分别为田间土壤最大持水量的50%(B1)和60%(B2),并以32℃/28℃、田间土壤最大持水量的75%为对照（CK）。各处理分别持续4、7、10 d(DAS)。【结果】不同处理导致叶片中Cry1Ac毒蛋白含量降低,且随着胁迫时间的延长,下降幅度增加。处理间相比,A1B2处理下降幅度最少,7 DAS后开始显著低于CK;A1B1处理下降幅度其次,4 DAS后显著低于CK;A2B1、A2B2处理在4 DAS显著下降。可溶性蛋白（SP）含量、硝酸还原酶（NR）、谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、游离氨基酸（aa）和谷氨酸合成酶（GOGAT）等活性变...     

转双价基因棉田昆虫群落的多样性研究

2002-2003年在田间研究了转双价基因(CrylAc CpTI)棉田昆虫群落的多样性,并分析了昆虫群落多样性的时间格局,结果表明,4种类型棉田昆虫群落的多样性指数以双价棉田和Bt棉田最高,其次为常规棉田,常规施药田最低;害虫亚群落多样性指数以双价棉和Bt棉田最高,其次为常规用药田,常规棉田最低;天敌亚群落多样性指数以双价棉田最高,其次为常规棉田和常规用药田,Bt棉田最低,4种类型棉田昆虫群落的多样性时间格局总体变化趋势为5月升高,6月下降,7～9月又有所回升。     

Dynamics of Bt cotton Cry1Ac protein content under an alternating high temperature regime and effects on nitrogen metabolism

This study was conducted to investigate the effects of alternating high temperature on Cry1Ac protein content on Bt cotton cultivars Sikang 1(SK-1,a conventional cultivar)and Sikang 3(SK-3,a hybrid cultivar).In 2011 and 2012,cotton plants were subjected to high temperature treatments ranging from 32 to 40℃ in climate chambers to investigate the effects of high temperature on boll shell insecticidal protein expression.The experiments showed that significant decline of the boll shell insecticidal protein was detected at temperatures higher than 38℃ after 24 h.Based on the results,the cotton plants were treated with the threshold temperature of 38℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.followed by a normal temperature of 27℃ during the remaining night hours(DH/NN)in 2012 and 2013.These treatments were conducted at peak boll growth stage for both cultivars in study periods of 0,4,7,and 10 d.Temperature treatment of 32℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.and 27℃ in the remaining hours was set as control.The results showed that,compared with the control,after the DH/NN stress treatment applied for 7 d,the boll shell Cry1Ac protein content level was significantly decreased by 19.1 and 17.5% for SK-1 and by 15.3 and 13.7% for SK-3 in 2012 and 2013,respectively.Further analysis of nitrogen metabolic physiology under DH/NN showed that the soluble protein content and the glutamic pyruvic transaminase(GPT)activities decreased slightly after 4 d,and then decreased sharply after 7 d.The free amino acid content and the protease content increased sharply after 7 d.The changes in SK-1 were greater than those in SK-3.These results suggest that under DH/NN stress,boll shell Cry1Ac protein content decline was delayed.Reduced protein synthesis and increased protein degradation in the boll shell decreased protein content,including Bt protein,which may reduce resistance to the cotton bollworm.