实时荧光定量PCR鉴定小麦矮腥黑穗菌技术研究

 【目的】建立荧光定量PCR体系以准确灵敏的鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)【方法】根据筛选的TCK独有差异基因片段（1 322 bp）设计特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5和TaqMan 探针CQUP1,建立SYBR GreenⅠ荧光染料法和TaqMan水解探针法定量PCR检测体系,并对体系进行优化。【结果】建立的两套定量PCR检测体系的检测下限相当,可达到0.1fg,对应的拷贝数为2.31×104个,检测灵敏度比常规PCR高2～3个数量级,均可成功鉴别出TCK与小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries (DC)Tul,TCT),并可快速准确检测小麦矮腥黑穗菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。【结论】建立的2种定量PCR检测技术可运用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。     

超分支滚环扩增法检测小麦矮腥黑穗菌

 【目的】建立小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn,TCK）的超分支滚环扩增（hyper- branched rolling cycle amplification,HRCA）检测体系,为小麦矮腥黑穗病的鉴定以及早期诊断提供了一种新的稳定、可靠的检测技术。【方法】锁式探针包含一个公共连接序列和在探针两端与靶DNA序列互补的2个序列。根据TCK的差异序列设计锁式探针两端序列,以此为基础建立了TCK超分支滚环扩增反应体系。以优化的HRCA反应条件为基础,确定检测体系的特异性和灵敏度。比较HRCA体系和常规PCR体系的性能,并利用这2种体系对来自中国出入检验检疫局截获的51个小麦样品进行了验证检测。【结果】HRCA体系能专一地检出小麦矮腥黑穗菌的DNA靶带,而TCT、TCL等近源种及健康小麦样品都不能扩增。HRCA检测TCK靶序列质粒DNA的下限为1 fg?μl-1,检测基因组DNA的下限为10 pg?μl-1,检测灵敏度比常规PCR检测体系高10倍。HRCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和准确性,更适合于TCK的检测及鉴定。【结论】稳定、灵敏、特异的小麦矮腥黑穗菌的HRCA检测体系的建立,为小麦矮腥黑穗病的早期诊断及其近源种的多靶标检测提供了同步检测技术。     

啤酒大麦药剂处理对TCK冬孢子的杀灭效果及问题

参考啤酒大麦加工工艺流程中所采用的药剂及浓度，设计不同浓度的漂白粉、石灰、甲醛以及石灰加漂白粉，对小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kuhn）（简称TCK）冬孢子分别处理4h，接种于3%琼脂培养基上，然后移入5℃生长箱内培养，观察药剂处理对孢子萌发率的影响。结果表明，漂白粉浓度达到0.05%以上时，孢子基本不能萌发；几种浓度的生石灰处理对TCK孢子几乎没有灭活作用；0.01%甲醛可以明显抑制TCK孢子的萌发；对TCK孢子直接浸水处理45d仍有50%以上的萌发率。大麦加工工艺中所采用的漂白粉及石灰处理浓度不足以杀灭TCK冬孢子；其污水处理中采用0.05%浓度的甲醛可抑制孢子的萌发。     

溴甲烷及其混剂杀灭小麦矮腥黑穗病菌的研究

用溴甲烷、氰、溴甲烷与二氧化碳混剂、溴甲烷与环氧乙烷混剂以及溴甲烷与氰混剂在室内不同条件下对小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kuhn,TCK）进行了熏蒸灭菌效果的比较。结果表明：1）溴甲烷对TCK的灭菌效果随温度的升高、处理时间的延长而提高;间隔48h的2次120h的熏蒸处理,能显著降低溴甲烷的杀菌临界浓度值;2）溴甲烷与环氧乙烷混剂能完全杀灭TCK病菌,且能显著降低溴甲烷和环氧乙烷的杀菌临界浓度,其混合作用的熏蒸效果较溴甲烷与二氧化碳、氰混合剂好;3）在20℃,50％小麦装载量条件下,180g·m^-3溴甲烷处理120h或90g·m^-3溴甲烷2次处理各120h,均可以达到100％的杀灭效果;4）溴甲烷及其混剂对小麦光腥黑穗病菌冬孢子萌发率的影响可作为对TCK冬孢子萌发影响的指示;5）将溴甲烷处理小麦与国产未处理小麦以1：2比例混配时,小麦中总溴含量可以降低到50mg·kg^-1水平以下,符合美国小麦卫生标准。     

渍水土壤中小麦矮化腥黑穗病菌活性研究

小麦矮化腥黑穗病菌（Tilletia controversa K（？）hn）冬孢子具有很强的抗逆性,在土壤中可存活10 a以上,该病害的阻断是一个历久弥新的问题.试验将小麦矮化腥黑穗病菌冬孢子埋于种植水稻的稻田,通过对埋土前后冬孢子的萌发率和自体荧光率的测定,研究小麦矮化腥黑穗病菌在稻田中活性的变化及冬孢子萌发与自体荧光之间的关系.2a试验结果表明：随着处理时间的延长,冬孢子的萌发率和自体荧光率均逐渐降低,经过一个完整稻季处理后,病菌冬孢子萌发活性和自体荧光特性都全部丧失,丧失自体荧光的冬孢子,其萌发活性也相应丧失.     

进口哈萨克斯坦刀小麦TCK等疫情对我区的影响

目前,小麦矮腥黑穗病菌（TilletiaCoIltI＇OVCl＇S3．Kuhn）即TCK是我国重要对外检疫性有害生物。在世界范围。TCK已传播至31个国家。新疆周边8个国家小麦染疫尤为普遍,哈萨克斯坦是TCK疫情的重要发生区。哈萨克斯坦共有14个州级行政区域,其小麦主产区中北部的阿克莫拉、北哈萨克斯坦和库斯塔奈3个州。是小麦矮腥黑穗病菌、小麦印度腥黑穗病菌等疫情的严重发生区。     

小麦品种对腥黑穗病抗性鉴定试验

在地处陕西渭北高原的合阳县进行了18个小麦品种对腥黑穗病抗性鉴定试验,结果表明：水地品种西高2号、小偃22、中育12和旱地品种长6359、长6135对小麦腥黑穗病抗性最好,病株率为0．05％～O．50％,其次为晋麦22、西农189、烟农18,病株率为1．51％～5．67％,其余10个品种病株率在17．87％～54．74％。     

渍水土壤中小麦矮化腥黑穗病菌活性研究

小麦矮化腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn)冬孢子具有很强的抗逆性,在土壤中可存活10 a以上,该病害的阻断是一个历久弥新的问题.试验将小麦矮化腥黑穗病菌冬孢子埋于种植水稻的稻田,通过对埋土前后冬孢子的萌发率和自体荧光率的测定,研究小麦矮化腥黑穗病菌在稻田中活性的变化及冬孢子萌发与自体荧光之间的关系.2 a试验结果表明:随着处理时间的延长,冬孢子的萌发率和自体荧光率均逐渐降低,经过一个完整稻季处理后,病菌冬孢子萌发活性和自体荧光特性都全部丧失,丧失自体荧光的冬孢子,其萌发活性也相应丧失.     

进口哈萨克斯坦小麦TCK等疫情对我区的影响

目前,小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kuhn)即TCK是我国重要对外检疫性有害生物。在世界范围,TCK已传播至31个国家。新疆周边8个国家小麦染疫尤为普遍,哈萨克斯坦是TCK疫情的重要发生区。哈萨克斯坦共有14个州级行政区域,其小麦主产区中北部的阿克莫拉、北哈萨克斯坦和库斯塔奈3个州,是小麦矮腥黑穗病菌、小麦印度腥黑穗病菌等疫情的严重发生区。     

美国小麦矮腥黑穗病的检验与控制

一、发生历史与现状美国小麦矮腥黑穗病(TilletiacontroversaKühn,以下简称TCK)的发生历史大致分为三个阶段:1.自然发生阶段(1892—1935)TCK尚未与小麦普通腥黑穗病区分开,研究很少。2.严重危害阶段(1935—1972)根据病株矮化、分蘖多、病菌冬孢子形态及萌发条件,首次确定了TCK(Young,1935),并认定主要在美国西北部蒙大拿、犹他、爱达荷、衣阿华、科罗拉多、华盛顿、俄勒冈等7州冬麦区发生流行,偶尔也在东北部大湖区局部地方发生,严重影响小麦品质与产量。20世纪60年代发生地块的产量损失率高达50%～68.7%,70年代初期西北部7州24万hm2…     

小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌的单孢检测

设计了小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)和黑麦草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri)通用引物H4／H7和H11／H12，结合T.indica特异性引物Tin3/Tin4和T.walkeri特异性引物Tin11／Tin4建立了检测T.indica和T.walkeri冬孢子的套式PCR(nested PCR)检测方法。检测的灵敏度达1个冬孢子，检测时间缩短为8h。PCR产物的测序验证了PCR反应的可靠性。这一方法克服了冬孢子休眠或不具存活力以及常规PCR检测时间长的困难，有效地解决了漏检问题。     

草坪草网腥黑粉菌洗涤检验研究

本试验比较了两种不同悬浮剂对草坪草网腥黑粉菌洗涤检验的影响，结果发现：用灭菌水作悬浮剂时，只有浓度为6000个孢子／克种子的条件下检测到孢子，其它低浓度均未观察到，而用席尔试液作悬浮剂时，所有浓度均可检测到孢子，说明在网腥黑粉茵洗涤检验中不能用灭菌水代替席尔试液作悬浮剂。另外，通过比较抽取10g和20g草种样本对洗涤检验的影响发现，两个样本洗涤检验结果差异不大，表明进行网腥黑粉茵洗涤检验时，抽取10g草种样品就能反映草种带菌的实际情况。     

进境黑麦草种子中黑麦草腥黑粉菌的鉴定

从广州（1997）和天津（1999）进境的美国黑麦草种子中均发现一种类似中国一类危险性有害生物小麦印度腥黑粉菌（Tilletia indica Mitra)的冬孢子。其大小分别为28．9－43．7μm和29．2－40．2μm，淡黄色至暗褐色，半透明至不透明，球形至亚球形，疣状突起常呈钝圆状，表面有脊状突起。检疫中常因其与印腥冬孢子极为相似而引起误诊。经形态学特征观察、PCR分析和PCR扩增产物测序分析，鉴定为黑麦草腥黑粉菌（Tilletia walkeri)。     

基于图像识别的小麦腥黑穗病害诊断技术研究

传统的检疫小麦腥黑穗病害的方法效率较低影响检测的稳定性和客观性.提出一种基于图像识别的小麦腥黑穗病分类诊断技术.以显微镜下采集的小麦病害图像为研究对象,对其进行滤波增强及病害区域分割,再提取单个病害区域图像的颜色、形状和纹理等特征参数;最后利用归一化后的特征值,通过BP神经网络分类器实现了小麦腥黑穗病害的诊断.将计算机图像识别结果和实际小麦腥黑穗病类型进行对比,表明了该诊断技术的可行性和有效性     

小麦网腥黑穗病菌微波处理技术研究

该文系统测定了不同功率、不同时间组合的微波处理对小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries)的杀灭效果,并分析了微波处理对小麦品质的影响.毒力测定结果表明,800W处理30s,640W处理40s,480W处理50s,320W处理80s和160W处理180s这5种剂量,可完全杀灭小麦中的网腥黑穗病菌;温度检测结果表明,热效应是微波杀菌的主要因素,微波加热到90℃才能完全杀灭网腥黑穗病菌菌瘿;品质检测结果表明,上述条件的微波处理能显著降低小麦的含水率和发芽率,对千粒质量无影响,同时能显著提高小麦的还原糖和脂肪酸质量分数.上述结果表明微波处理在杀灭小麦网腥黑穗病菌菌瘿的同时能保持小麦的贮藏品质,因而在储粮检疫处理中极具应用前景.     

热处理防除小麦网腥黑穗病菌（Tilletia caries）的效果

在70℃、80℃两个温度,50%、65%和80%3个相对湿度下,对小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries,TCT)进行热处理。结果表明,240min内可完全杀灭TCT孢子的处理组合为70℃、50%RH,80℃、50%RH,80℃、65%RH,80℃、80%RH,有效杀死TCT孢子的处理时间分别为40、240、20和5min。品质测定结果表明:热处理可导致小麦麦粒的含水率明显下降,对干物质含量影响较小。热处理降低了小麦的生活力,加快了小麦的呼吸速率及营养物质分解。     

小麦矮腥黑穗病菌冬孢子的热力灭菌研究

利用热力对病菌冬孢子进行灭菌的研究，以解决带菌的粮用小麦加工后，麦麸如何灭菌的问题。通过试验表明病菌冬孢子经过湿热处理６５℃１０ｍｉｎ即可灭菌，而以７０℃１０ｍｉｎ和８Ｏ℃５～１０ｍｉｎ为可靠的灭菌条件，干热处理１００℃１０ｍｉｎ不能灭菌，带菌麦麸只有经过湿热处理后才能用作饲料。     

小麦腥黑穗病冬孢子显微图像的获取及处理

针对入境小麦腥黑穗病检验检疫中冬孢子区域计数问题,提出了小麦腥黑穗病图像处理的方法和流程.首先介绍了显微镜下腥黑穗病菌冬孢子图像的获取方法;在将冬孢子的彩色图像灰度化后,采用中值滤波抑制噪声,利用metric算法进行图像分割;为了从背景中准确提取冬孢子区域,流程中采用图像形态学方法来消除二值图像中冬孢子区域的背景噪声和孔洞,并剔除图像边界处不完整的冬孢子区域;最后采用区域标记的方法获得了冬孢子数目.结果表明,该研究提出的方法和流程能有效地改善图像的质量,并能够自动准确地提取并统计冬孢子区域,便于后续的识别工作.