1株类NADC30与类JXA1重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传特征分析

旨在分析本实验室2017年从临床病料中分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的分子遗传特征,测定了其全基因组序列,并运用生物信息学软件对其遗传特点进行了分析。结果显示,该毒株基因组全长15 054 bp,与代表性毒株VR-2332、NADC30、CH-1a、JXA1和QYYZ的核苷酸相似性分别为84.5%、93.4%、84.2%、83.9%和82.1%。系统进化树分析显示,该毒株与NADC30-like毒株处于同一进化分支,属于lineage 1。基于GP5和Nsp2蛋白的氨基酸序列分析显示,分离株GP5蛋白糖基化位点位于34位、44位和51位;在37—45 aa的线性表位区较为保守,在27—30 aa和37—45 aa的线性表位区存在特异的氨基酸位点变异;Nsp2蛋白存在NADC30-lke毒株特征性的131个(323—433位、483位、504—522位)不连续氨基酸的缺失。基因重组分析显示,该毒株以类NADC30为主要亲本、以类JXA1为次要亲本,在Nsp2的氨基端(1 340—2 082 nt)发生了基因重组。本研究成功绘制了1株NADC30-like毒株的基因组遗传特征,确定了其在Nsp2区域发生了基因重组,提示PRRSV通过基因重组在不断发生遗传演化,开展持续的PRRSV流行及遗传变异监测对于该病的防控具有重要意义。     

1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析

对山东省某地区初诊为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduction and respiatory syndrome,PRRS)的猪病料采用RT-PCR进行鉴定,获得1株PRRSV并命名为SD18。对该分离株的第2代细胞培养毒株进行全基因组测序,与其他参考毒株比较同源性并构建遗传进化树。结果显示,SD18毒株属于美洲型高致病性PRRSV变异株,该毒株Nsp2基因具有31个不连续的氨基酸缺失,已明显区别于以JXA1、HUN4、TJ株等为代表的30个不连续缺失高致病性分离株,其中第830位氨基酸位点是最新发现的缺失氨基酸。同时,该毒株的ORF3基因第17位插入1个丝氨酸(S),而ORF5基因编码的第13位和第151位氨基酸均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位则插入了具有野毒特性的丝氨酸(S),这4个氨基酸位点也表现出不同于以往高致病性毒株变异的特征。采用基因重组分析软件RDP4分析表明,该新型缺失株的多个部位发生了基因重组;SD18毒株病毒以美洲经典毒株VR2332作为重组的主要亲本毒株,疫苗株JXA1-R和新型毒株NADC30-like提供重组片段,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。综合分析表明,山东地区SD18分离株Nsp2、GP3、GP5相应氨基酸均出现了较大变异,特别是Nsp2出现一个新的氨基酸缺失,可能是该毒株形成了一个新的独立变异分支的重要原因;这些变异也提示该分离毒株在病毒编码蛋白及其免疫原性等方面出现了较大变化。该病毒株的成功分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV衍化及流行病学调查积累了最新数据,也为预防控制该病提供参考。     

1株类NADC30与类JXA1重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传特征分析

旨在分析本实验室2017年从临床病料中分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的分子遗传特征,测定了其全基因组序列,并运用生物信息学软件对其遗传特点进行了分析。结果显示,该毒株基因组全长15 054 bp,与代表性毒株VR-2332、NADC30、CH-1a、JXA1和QYYZ的核苷酸相似性分别为84.5%、93.4%、84.2%、83.9%和82.1%。系统进化树分析显示,该毒株与NADC30-like毒株处于同一进化分支,属于lineage 1。基于GP5和Nsp2蛋白的氨基酸序列分析显示,分离株GP5蛋白糖基化位点位于34位、44位和51位;在37-45 aa的线性表位区较为保守,在27-30 aa和37-45 aa的线性表位区存在特异的氨基酸位点变异;Nsp2蛋白存在NADC30-lke毒株特征性的131个（323-433位、483位、504-522位）不连续氨基酸的缺失。基因重组分析显示,该毒株以类NADC30为主要亲本、以类JXA1为次要亲本,在Nsp2的氨基端（1 340-2 082 nt）发生了基因重组。本研究成功绘制了1株NADC30-like毒株的基因组遗传特征,确定了其在Nsp2区域发生了基因重组,提示PRRSV通过基因重组在不断发生遗传演化,开展持续的PRRSV流行及遗传变异监测对于该病的防控具有重要意义。     

山东及周边部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异与遗传演化分析

为了解中国山东及周边部分地区自2017年以来猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的分子流行病学特征、基因组变化规律,作者收集来自山东省、河南省和江苏省的部分猪场采集及送检的疑似PRRS症状猪组织样品70份,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测。对部分阳性病料中PRRSV的基因重组、决定中国高致病性PRRSV(HP-PRRSV)致病性和复制力的Nsp9第561、586和592位氨基酸等进行分析,以探明该区域PRRSV的遗传演化规律。结果显示,PRRSV检出率为55.7%,从上述样品筛选11株PRRSV分离株。Nsp2序列分析显示,与经典美洲毒株VR-2332相比,7株PRRSV分离株的Nsp2蛋白分别在第481及533-561位发生了30个氨基酸的不连续缺失,这与我国自2006年以来流行的HP-PRRSV的缺失特征相同;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在481、533-561及595-597位发生了三个部位的共33个不连续氨基酸的缺失;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在475-518及533-561位出现了两个部位的共73个不连续氨基酸的缺失。该研究中PRRSV分离毒株的Nsp2基因已发生了明显的新型缺失。采用基因重组分析软件RDP4分析显示,以上后4株新型缺失株存在较大的基因重组,且重组部位和重组片段数量不相同;4株病毒均以高致病性毒株JXA1作为重组的主要亲本毒株,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在其他非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。另外,Nsp9第561、586和592位氨基酸变异分析显示,该4株病毒在上述三个氨基酸位点与中国HP-PRRSV相符。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。     

山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离株gC抗原基因的变异分析

为了解当前山东省猪伪狂犬病病毒(PRV)流行特点及病毒gC抗原基因的变异情况,本研究对2018年来自山东省不同地区的23份猪伪狂犬病疑似病料进行PRV的分离鉴定,并对分离株的gC抗原基因进行扩增及序列分析。结果表明,共分离到9株PRV;gC基因同源性比对结果显示,分离株与2012年之后国内PRV变异株的核苷酸及氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株;遗传进化树及推导氨基酸序列分析结果显示,分离株与国内2012年后分离到的变异毒株同属于GenotypeⅡ;因此,推测目前山东省流行的PRV以变异毒株为主。9株分离株与Bartha-K61疫苗株相比,糖基化蛋白gC在潜在抗原位点和O-糖基化位点的重要位置(aa23～aa453)发生改变,这或许会影响分离株的抗原性,从而有助于其逃避宿主免疫防御,最终造成疫苗诱导产生的中和抗体不能有效地中和目前流行的变异PRV。本研究为变异PRV的防控及相关疫苗研制提供了一定的理论依据。     

猪伪狂犬病病毒变异株GD株的分离鉴定及TK和gE基因的进化分析

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行变异毒株的病原学特性及分子遗传变异特点,本研究从广东省某疑似暴发猪伪狂犬病的猪场采集的病料中分离到一株PRV毒株,命名为GD株。该病毒在PK-15细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,病毒滴度可达109.0 TCID50/mL。将病毒感染KM SPF小鼠,接种小鼠在4 d内全部死亡,并且均出现典型的PR症状。序列比对结果显示,PRV GD株的TK和gE基因与国内外PRV参考株的核苷酸同源性分别为99.4%～100%和97.6～99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%～100%和95.5%～99.8%。基于gE基因的遗传进化分析发现,PRV GD株与国内近几年分离鉴定的流行变异毒株位于同一分支上。与经典株相比,PRV GD株的gE蛋白氨基酸序列在48和496位均有1个天冬氨酸(D)的插入,符合PRV变异株的典型特征。本研究成功分离到一株PRV变异株,为PRV流行变异毒株的防控和新型疫苗的研究提供一定的科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株全基因组序列测定及遗传变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征的弱毒(PRRSV)株在基因组水平上的变异和分子遗传特征,本研究对致弱毒株CH-1R株进行了全基因组序列的测定。结果表明,CH-1R株基因组序列全长15424nt,具有典型的动脉炎病毒基因组结构。通过与亲本株CH-1a株序列进行比对,发现其基因组内碱基的缺失和突变主要分布在ORF1a基因的第2191位～2193位、ORF5基因的第439位、ORF6基因的第49位和ORF7基因的第28位和第139位。其中PRRSVCH-1R株的Nsp2蛋白和结构蛋白的变异相对较大,尤其是Nsp2蛋白的变异,同CH-la株相比,CH-1R株的Nsp2蛋白存在多处核苷酸的突变,其中包括连续3个核苷酸发生缺失;由结构蛋白基因推导的氨基酸序列共有17处变异,在各结构蛋白中以GP3和GP5蛋白变异较大,而高度保守的M蛋白和N蛋白,同样发生了变异,由此预测了Nsp2蛋白的R631E、GP5蛋白的L146Q、M蛋白的Q16L和N蛋白的K46N处毒力相关的氨基酸位点,推测其在毒株致弱过程中起到了重要的作用。     

2007-2010年河北省部分地区猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学

为了弄清河北省秦皇岛、唐山、廊坊、邯郸等部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5和Nsp2基因变异情况,对采自以上地区在2007—2010年期间的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT—PCR扩增样本中PRRSV的ORF5和Nsp2基因,对目的基因测序,并以VR-2332、CH—la、MLV、LV、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株为参考序列,进行序列分析和进化树分析。扩增出42个ORF5基因,14个Nsp2基因,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现所有毒株均为美洲型,且大多数毒株与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病力毒株同源关系很近。42个ORF5基因编码的氨基酸序列分析表明GP5蛋白的糖基化位点数量和位置已发生变异,主要中和表位存在氨基酸变异（L／F^35→I^39）,与毒力相关的13位和151位点为强毒株的氨基酸特性（R^13、R^151）。14个Nsp2基因推导的氨基酸系列比较发现,1株PRRSV Nsp2基因未发生缺失突变,而剩余的13个毒株Nsp2基因均发生了氨基酸缺失,在481位和532～560位2处分别缺失1和29个氨基酸。系统发育进化树结果显示河北部分地区流行株分为2个小分支,1个毒株与HB-1聚为1支;河北流行株的大多数毒株在另一个分支,与高致病力毒株JXA1等聚为一支。本研究结果揭示了河北省部分地区流行的PRRSV ORF5和Nsp2基因的变异特征,丰富了河北省的PRRSV分子流行病学资料,提示要针对ORF5和Nsp2基因的变异采取PRRSV的防控措施。     

猪流行性腹泻病毒LN-2015-1株分离鉴定及其S基因的变异分析

为了解辽宁猪流行性腹泻病毒(PEDV)来源及变异特性,经PCR诊断,细胞分离,细胞病变观察、RT-PCR以及S基因序列鉴定,成功分离1株PEDV毒株(LN-2015-1)。S基因序列分析显示,与CV777毒株相比,除点突变外,分离株还出现最长9bp的插入,6bp的缺失和13bp连续突变。氨基酸也存在最长3aa插入和2aa缺失,同时存在4处连续3个及以上的氨基酸突变,抗原表位分析表明在5个表位区共发生16个氨基酸的突变。同源性分析显示与HB-HA2015毒株的同源关系最近,序列相似性为99.2%,与2010年以来国内外代表变异毒株同源性较高,达到98.5%~98.8%,而与2010年以前的传统同源性较低,在93.2%~95.6%之间;进化树分析显示该毒株与近年来国内外流行的变异毒株属于同一群,并且与HB-HA2015形成一小的分支,而与传统毒株进化距离较远。     

猪流行性腹泻病毒Nsp7蛋白的表达与多克隆抗体制备

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白7(Nsp7)的结构特征和免疫原性,本研究通过生物信息学分析Nsp7蛋白序列特征及空间结构,在此基础上对Nsp7进行原核表达和纯化,并制备抗Nsp7多克隆抗体。结果显示,Nsp7基因在PEDV不同毒株间高度保守,Nsp7蛋白的三级结构主要由4个α螺旋片组成。SDS-PAGE试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,重组蛋白大小为9.2 ku,经纯化后得到单一条带。采用纯化的Nsp7免疫兔制备多克隆抗体,然后经Western blot和间接免疫荧光试验鉴定,多克隆抗体能够特异性识别重组Nsp7蛋白和PEDV感染细胞的Nsp7蛋白,证明Nsp7免疫原性良好,为后续研究Nsp7的功能及研制以Nsp7为检测靶标的PEDV诊断试剂盒奠定基础。