水稻花期特异表达基因的cDNA和RNA阵列检测

用水稻孕穗期、开花期总mRNA为探针与含有2200个独立基因的cDNA阵列杂交,以检测开花期群体基因的表达谱。结果发现,在所获得的1720个有效克隆当中,有472条基因表达下调（占27.44％）,892条为持家基因（占51.86％）,356条基因表达上调（占20.70％）。表达上调的基因中有250个功能已知（占14.53％）,106个是功能未知的新基因（占6.16％）。其中S 腺苷甲硫氨酸还原酶、查尔酮合酶、酰基载体蛋白Ⅱ基因、过敏反应蛋白、醇溶蛋白、3-酮脂酰载体蛋白合酶Ⅲ和β-D-(1→3)-葡聚糖外水解酶等基因参与水稻开花和胚胎发育过程。为了进一步验证它们与开花过程的相关性,选取查尔酮合酶、酰基载体蛋白Ⅱ、醇溶蛋白、S-腺苷基甲硫氨酸还原酶和过敏反应蛋白等5个基因为探针,与755个水稻RNA斑点阵列进行杂交。结果证实醇溶蛋白和过敏反应蛋白基因受发育调节在乳熟成穗中高表达,查尔酮合酶和S-腺苷基甲硫氨酸还原酶基因在叶片中受光诱导、在根中受缺氮胁迫时高表达。在所有表型中,查尔酮合酶、S-腺苷基甲硫氨酸还原酶和酰基载体蛋白Ⅱ基因有相近的表达趋势,过敏反应蛋白和醇溶蛋白基因的表达趋势也相近。     

花生AhFUSCA3基因的原核表达及在非生物胁迫下的表达分析

根据本实验室已获得的花生AhFUSCA3基因(NCBI登录号JX420284)序列,设计特异引物,构建原核表达载体,进行了重组蛋白表达分析,获得了分子量为42KD左右的目的蛋白条带;利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time RT-PCR)方法,检测了AhFUSCA3基因在低温、高盐和干旱胁迫条件下的表达情况。结果显示,AhFUSCA3基因在低温和高盐处理的花生叶片中表达量明显上调,但在干旱处理的叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhFUSCA3基因可能参与了花生对低温、高盐和干旱的抗性调控。     

外源木聚糖酶基因atx在水稻中的表达

 为通过在转基因植株中表达木聚糖酶来提高木聚糖酶的生产效率,将具有较高热稳定性和催化活性的杂合木聚糖酶基因atx连接到双元表达载体pCAMBIA1301上,成功构建了木聚糖酶植物表达载体atx Ru3ep 1301。然后以水稻成熟胚的愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将木聚糖酶基因导入水稻(中花11)中。经过潮霉素抗性检测和PCR鉴定,证实目的基因已经整合到转基因水稻基因组中。RT PCR分析结果显示,外源木聚糖酶基因能够在CaMV 35S启动子的引导下在转基因水稻中正常转录。转基因水稻能够正常生长和繁殖。木聚糖酶活性分析表明,转基因植株最高木聚糖酶活性约为4.37 U/g（鲜叶片）。因此,利用转基因水稻生产木聚糖酶将会是一种经济、有效的方法。     

红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定

以pET-28a-RFP质粒为模板,PCR扩增红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因,并克隆到真核表达载体pTE11上,置于RP27启动子调控之下,成功构建表达载体pTE11-RFP。采用PEG介导转化法,将pTE11-RFP转入银耳芽孢中。提取转化子基因组DNA,RFP基因特异性引物扩增获得与目的基因大小一致的特异条带;日光下肉眼观察转化子略显红色,荧光显微镜观察有明显的红色荧光。以上结果证明RFP基因已成功转入银耳芽孢并进行表达,RP27启动子可以调控外源基因RFP在银耳芽孢中的正确表达,为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定了一定的基础。     

水稻OsWRKY7基因的表达研究

WRKY蛋白是植物中一类重要的转录因子,不仅参与植物生长发育的调控,还参与植物对各种生物和非生物胁迫的响应。本研究从水稻日本晴中分离OsWRKY7基因的编码序列(CDS),并克隆其启动子序列进行表达研究。首先通过实时定量PCR的方法检测不同组织中OsWRKY7基因的相对表达量,结果表明,OsWRKY7在叶片中的表达水平较高,且开花期的剑叶中表达量高于7 d苗龄的幼叶。进一步将OsWRKY7启动子与GUS报告基因融合,构建了植物表达载体pOsWRKY7-GUS,并将此载体转化日本晴。转基因植株不同组织染色分析结果显示,该启动子在植株的主根尖、叶片、颖壳中有GUS活性,其中叶片上可见全叶范围分布的大量蓝色斑点,这些染色结果与实时定量PCR的结果一致。进一步的接菌和激素处理还显示,OsWRKY7启动子在根和叶中的表达均受水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzae pv. Oryzae(Xoo)]P10生理小种侵染的诱导,同时还受外源施加的细胞分裂素和生长素诱导,而水杨酸则会抑制其在根和叶中的表达。此外,我们还将OsWRKY7基因的CDS序列分别与绿色荧光蛋白和酵母GAL4的DNA结合域融合,对该基因进行水稻茎原生质体亚细胞定位分析和酵母自激活检验,结果显示该基因定位于细胞核中并具有转录自激活活性。上述结果表明OsWRKY7具有明显的转录激活因子特征,其很可能参与了水稻对白叶枯菌的防御反应以及对多种激素信号的转导过程。     

粗山羊草叶绿体基因RNA编辑位点的鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后表达调控的一种重要方式。本研究利用生物信息学方法,预测出粗山羊草叶绿体基因组分布于15个蛋白编码基因的34个RNA编辑位点,均为C到U的转换,其中以ndhB最多,有9个编辑位点。通过与数据库中EST和高通量测序数据(SRA)进行比对分析,检测到分布于20个基因的29个编辑位点。综合上述研究结果,最终确定分布于9个基因的10个RNA编辑位点是真实存在的。分析这些位点RNA编辑现象对蛋白质结构的影响,发现ndhB编辑后β-折叠数增加,跨膜结构增加。这是首次有关粗山羊草叶绿体蛋白编码基因RNA编辑位点的报道。与禾本科水稻、玉米、大麦、黑麦和甘蔗的叶绿体RNA编辑位点进行比较,表明粗山羊草与黑麦、大麦的亲缘关系较近。本研究结果可为解析粗山羊草叶绿体基因的表达调控和探讨禾本科物种的起源进化提供理论依据。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

转基因大麦中gfp基因的遗传及表达研究

为了探索转基因遗传及染色体重组对转基因表达的影响,以4个转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦系与野生型大麦相互杂交,通过对F<,2根尖和花粉细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的检测,研究了转基因的遗传方式和表达.结果表明,绿色荧光蛋白基因在单位点和双位点插入的转基因系与野生型大麦杂交的F<,2群体中分别表现3:1和15:1的遗传分离,符合孟德尔式遗传,并表现基因的剂量效应;不同转基因系问相互杂交后代同样表现孟德尔式遗传,并出现转基因gfP表达水平提高的个体;转基因沉默系参与的杂交后代继续表现其转基因沉默.     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

海南普通野生稻OrNAC5的克隆和表达分析

根据EST序列信息,从海南普通野生稻中克隆了一个NAC(NAM,ATAF and CUC)类转录因子OrNAC5。该基因编码区cDNA长度699 bp,编码232个氨基酸,对应的DNA长度为2 538 bp,含有3个外显子和2个内含子。推导的OrNAC5氨基酸序列具有典型的NAC类转录因子结构特征,与水稻(Oryza sativa)、短花药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeum vulgare)、谷子(Setaria italica)中相应蛋白的同源性分别为99%、81%、60%和58%。对OrNAC5启动子序列进行分析,结果发现存在多种激素应答和胁迫响应的调控元件。Real-Time PCR结果显示,低温、干旱和盐胁迫均能诱导OrNAC5的表达。上述结果表明OrNAC5可能在逆境响应过程中具有重要功能。     

水稻OsWRKY89基因启动子的表达特性

利用PCR技术从粳稻品种秀水11中扩增了转录因子WRKY89编码区5′上游大小为1470 bp的调控序列,命名为OsW89p,将它与GUS基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法将载体转化水稻,GUS组织化学分析结果表明,OsW89p驱动的GUS基因在转基因植株各个时期的叶、茎和叶鞘中均有表达;在花器的外稃和花药中有活性而在花粉和成熟种子中均无活性;种子萌发时在胚中有活性;2.5叶期时在种子根、不定根和侧根中均有活性但根尖中无活性,5叶期时根部只有侧根中有活性。分析了GUS在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明：1) GUS的表达被茉莉酸甲酯增强,诱导倍数是4.0,被2,4 D抑制,水杨酸对OsW89p的表达几乎没有影响;2) 用NaCl和PEG这2种非生物因子处理转基因苗根部,根中GUS的表达被抑制,但叶片中可被诱导增强;3) GUS的表达可被紫外线照射、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理这4种非生物逆境因子增强,其中以紫外线照射处理的诱导倍数最高。     

水稻抗感纹枯病品种Ospgip1基因的表达特征

 从水稻基因组DNA中扩增出1 184 bp的Ospgip1基因片段。该片段包含930 bp的完整开放阅读框,终止密码子为TAA,无内含子。RT PCR结果表明,Ospgip1基因在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但不同生育期、不同部位表达量有差异。实时PCR结果显示,抗病品种YSBR1和中感品种Jasmine 85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont;稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达量均显著提高;纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。     

额种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原载体构建及转化水稻

应用水稻种子生物反应器开发口服重组胰岛素原具有重要应用前景。通过分子设计保证重组胰岛素原在人体肠道内的自主加工成熟,根据水稻密码子偏爱性人工合成了霍乱毒素β亚基和人胰岛素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin,CTBIN),并在C末端添加内质网滞留信号KDEL。通过PCR技术从粳稻品种日本晴全基因组中克隆谷蛋白启动子及其信号肽序列pGluB1sig(GluB1 promoter and its signal peptide)用于驱动融合基因CTBIN的表达,插入载体pCAMBIA1302,构建了水稻种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原的载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-Nos。采用农杆菌介导法转化日本晴,获得了46株转基因水稻植株,Western杂交检测到CTB-人胰岛素原融合蛋白在水稻种子中表达。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。     

水稻异淀粉酶基因ISA1及其启动子的表达特性分析

 利用实时定量RT-PCR方法研究了水稻异淀粉酶基因ISA1在各组织及不同发育阶段籽粒中的表达模式,结果表明该基因只在发育籽粒中表达。同时,克隆了ISA1基因起始密码子上游1.1 kb和2.1 kb两个不同长度的启动子片段,并分别与GUS报告基因融合,经农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量结果表明,2.1 kb的ISA1启动子具有很好的胚乳表达特异性,与内源基因定量表达分析的结果一致;而1.1 kb的ISA1启动子则不具备该表达特性,它在胚乳、茎、茎节及谷壳中都有很高的表达。这可能是因为 2.1 kb启动子中含有抑制目的基因在茎等组织或器官中表达的顺式作用元件。     

稻水象甲卵巢内β1 微管蛋白基因cDNA全长的克隆及定量表达分析

 利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）和反转录聚合酶链式反应（RT PCR）分别对中国的孤雌生殖型和美国的两性生殖型稻水象甲卵巢内β1 微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长分别为1727 bp和1730 bp,均包含1344 bp的完整开放阅读框(ORF),编码447个氨基酸,理论分子量约50 kD,等电点4.54。同源性分析表明,克隆的β1 微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,相似性介于95%~100%。荧光定量PCR分析表明,β1 微管蛋白在孤雌生殖型稻水象甲卵巢内的表达量（3.14×107 copies/μL±0.66×107 copies/μL）显著高于两性生殖型稻水象甲（508×106 copies/μL± 047×106 copies/μL）。推测该基因的差异表达对于稻水象甲孤雌生殖过程中纺锤体的组装具有重要意义。