一个麻疯树AP2/ERF家族基因的克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆1个麻疯树AP2/EFR家族的基因,并构建其植物表达载体。[方法]利用麻疯树EST数据库中的AP2/ERF相关信息设计引物,通过RT-PCR克隆麻疯树AP2/EFR家族的基因,用生物信息学方法对其序列进行分析,并构建其植物表达载体。[结果]试验克隆到1个AP2/EFR家族基因JcERF;从cDNA序列、氨基酸序列、保守域序列、功能组成、理化性质、进化树等方面进行分析,结果显示JcERF属于AP2/EFR家族中的ERF亚家族;将JcERF连接至pCAMBIA1301载体上,构建了以35S为启动子的植物表达载体。[结论]该研究为麻疯树中JcERF的功能研究及提高麻疯树的抗逆性奠定了基础。     

干旱胁迫下麻疯树毒蛋白的Western杂交分析

用 10 %～ 4 0 %聚乙二醇 (PEG 6 0 0 0 )处理麻疯树幼苗进行蛋白质诱导 .SDS PAGE显示 ,在根、茎、叶中分别诱导出分子量大约为 17和 30kD、17和 35kD及 15、17、32、5 3、5 6、6 1和 6 5kD的蛋白质多肽链 .用麻疯树毒蛋白(curcin)的抗血清与诱导蛋白进行Western杂交 .结果显示 ,在叶的诱导蛋白中出现分子量为 32和 6 5kD的阳性反应带 ,而在根、茎中无 .这一结果表明干旱胁迫下麻疯树蛋白质分子标记的存在 ,为逆境蛋白的研究奠定了实验基础 .     

L-谷氨酰胺对麻疯树再生不定芽生根效果的影响

[目的]建立促进麻疯树再生不定芽生根的组培体系。[方法]通过在诱导麻疯树再生不定芽分化生根的培养基(MS+0.3 mg/L IBA)中添加一定浓度的L-谷氨酰胺(Gln)来达到促进芽条生根的效果。[结果]在诱导麻疯树再生不定芽分化生根的培养基中添加20 mg/L Gln,可以显著提高芽条的生根率,生根率可达40%~50%。同时,可以在短时间内就获得较高的生根率,显著缩短了获得完整植株的周期。此外,还减少了生根过程中常见的再生植株叶片发黄、容易脱落现象的发生,显著提高了所获得的再生完整植株的质量。[结论]麻疯树生根培养基的最优组合为添加0.3 mg/L IBA和20 mg/L Gln的MS培养基,应用该研究建立的组培体系可显著改善麻疯树再生不定芽的生根效果。     

毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。     

麻疯树白粉病的病原鉴定及药剂防治研究

[目的]为控制基地麻疯树白粉病的流行提供科学依据。[方法]通过制片镜检对云南省元阳县膏桐良种繁育基地的麻疯树白粉病进行病原鉴定。[结果]麻疯树白粉病病原为白尘粉孢(Oidium leucoconium Desm)。初选了1个杀菌剂组合进行田间药效试验,初步结果表明,该药剂组合能促进植株正常生长发育,防治麻疯树白粉病效果明显,在病害发展较快时,间隔7d连续施药2次,防效高达85.3%;药剂处理有明显的促进生长作用,施用过试验药剂的麻疯树1月份不仅不落叶,枝梢还明显生长,并于3月份结果;且施用该药剂安全无药害。[结论]为麻疯树白粉病的防治提供了一种比较经济和有效的方法。     

麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

[目的]克隆麻疯树(Jatrapha curcas)油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8,并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp,推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。     

弓形虫AMA1蛋白的原核表达载体的构建及体外表达

[目的]构建截短型AMA1的原核表达载体,并进行体外诱导表达,为在体外表达弓形虫AMA1重组蛋白。[方法]设计去掉弓形虫AMA1信号肽的PCR引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物酶切后与pGEX-4T-3原核表达载体连接,并转化到BL21感受态细胞内。对经PCR鉴定为阳性的重组质粒pGEX-4T-3-AMA1进行体外诱导表达。[结果]成功构建了弓形虫AMA1的原核表达质粒pGEX-4T-3-AMA1,通过体外诱导表明,AMA1融合蛋白是以包涵体的形式存在。[结论]弓形虫AMA1蛋白的体外表达为进一步制备抗AMA1血清及免疫学实验奠定了基础。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

麻疯树(Jatropha curcas)叶浸提液对万寿菊(Tagetes erecta L.)幼苗生长和抗氧化酶活性的化感影响

[目的]研究麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗生长和抗氧化酶活性的化感影响,揭示麻疯树对林下植物的化感生理机制。[方法]对麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗的生长、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Proline）和抗氧化酶系统的影响进行研究和分析。[结果]与对照相比,麻疯树叶浸提液加入土壤后,明显抑制了万寿菊根和茎的生长;在叶浸提液中,万寿菊根中的O2-、H2O2、丙二醛和脯氨酸的含量升高,且浸提液浓度的增加而增加;另外,麻疯树叶浸提液在较低浓度时,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性无显著变化,而在较高浓度时,SOD酶活性明显增加;所有浓度的叶浸提液都显著增加了万寿菊根中过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性,且随着浓度的增加而增加。[结论]麻疯树能释放化感物质进入土壤,抑制植物的生长和生理,改变植物群落组成和结构。     

麻疯树(Jatropha curcas)叶浸提液对万寿菊(Tagetes erecta L.)幼苗生长和抗氧化酶活性的影响(英文)

[目的]研究麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗生长和抗氧化酶活性的化感影响,揭示麻疯树对林下植物的化感生理机制。[方法]对麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗的生长、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Proline)和抗氧化酶系统的影响进行研究和分析。[结果]与对照相比,麻疯树叶浸提液加入土壤后,明显抑制了万寿菊根和茎的生长;同时,在叶浸提液中,万寿菊根中的O2-、H2O2、丙二醛和脯氨酸的含量升高,且浸提液浓度的增加而增加;另外,麻疯树叶浸提液在较低浓度时,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性无显著变化,而在较高浓度时,SOD酶活性明显增加;所有浓度的叶浸提液都显著增加了万寿菊根中过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,且随着浓度的增加而增加。[结论]麻疯树能释放化感物质进入土壤,抑制植物的生长和生理,改变植物群落组成和结构。     

小桐子种子萌发试验

[目的]为小桐子的种植和相关研究提供参考。[方法]以成熟小桐子种子为材料,研究种子储存时间（0、30、60、90 d）、发芽温度（10、20、27、35℃）、沙子含水量（2%、4%、8%）、播种深度（0、0.5、1 cm）、去皮处理（2端去皮、单端去皮、不去皮）对其发芽率和发芽势的影响。[结果]种子储存时间对小桐子种子发芽率和发芽势无显著影响;10℃条件下小桐子种子不能萌发,在20-35℃范围内,种子发芽率随温度升高而升高,27℃时发芽率最高;沙子含水量为2%、4%、8%时种子发芽率分别为67%、96%和48%;播种深度为0、0.5 cm时发芽率较高;单端去皮种子发芽率和发芽势较高。[结论]小桐子种子萌发的最适温度为27℃,最适沙子含水量为4%。     

麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗氮代谢的影响

[目的]揭示麻疯树对林下植物的化感生理机制。[方法]研究麻疯树叶浸提液对万寿菊幼苗叶片的叶绿素总量、蛋白质、硝态氮、铵态氮及与氮代谢相关的酶的影响。[结果]与对照相比,麻疯树叶浸提液加入土壤后,明显抑制了万寿菊总叶绿素含量。同时,叶浸提液也减少了叶片中总氮、蛋白质和硝态氮含量,但增加了铵态氮的含量,而且这种效应随着叶浸提液浓度的增加而增加。另外,麻疯树叶浸提液在较低浓度时,硝酸还原酶(NR)和谷氨酸合成酶(GS)活性没有显著变化,但在较高浓度时,NR和GS酶活性明显降低。谷氨酸脱氢酶(GDH)活性随着叶浸提液浓度增加而增加。[结论]麻疯树能释放化感物质进入土壤,通过干扰氮代谢的生理活动,抑制植物的生长。     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

一个新的麻疯树毒蛋白基因(Curcin-L2)的克隆和表达分析

麻疯树毒蛋白为I型核糖体失活蛋白(RIPs),目前已从麻疯树中克隆了3个毒蛋白基因。通过搜索麻疯树全基因组序列,找到了12个RIPs的编码基因,半定量RT-PCR结果表明,其中1个基因是叶特异表达基因。通过设计全长引物克隆得到了这个新的RIP编码基因,命名为Curcin-L2。序列分析表明,基因无内含子,ORF长945 bp,编码一个长314个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构分析表明,Curcin-L2具有一个保守的RIP结构域。进一步分析了Curcin-L2的启动子序列,结果表明该基因含有激素、热胁迫、光、蔗糖等调控元件。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

遮阴处理对小桐子幼苗生长的影响

[目的]为小桐子的大面积种植提供科学依据。[方法]设计4.8%、14.9%、46.0%、100%4种透光率,研究遮阴处理对小桐子幼苗生长的影响。[结果]随着遮阴强度的增加,小桐子幼苗的气孔密度、比叶重、叶绿素a/b值、单位叶面积鲜重、光补偿点、叶片最大净光合速率均下降,而叶片的呼吸速率、表观量子效率不同程度地增加。低光强下光-光合曲线的直线方程的相关系数为0.942 3～0.994 8,表明低光强下光与光合速率呈良好的线性关系。[结论]遮阴处理下,小桐子植株的生理指标有了不同程度的变化,表现出植株对弱光的利用能力增强,对强光的利用能力减弱。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。     

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。