抗菌肽FAPs在毕赤酵母中的重组表达研究

将4种抗菌肽Fowlicidin-2、Cecropin B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和Thanatin串联,并在每种抗菌肽N-末端加上Kex2蛋白酶裂解位点,根据毕赤酵母密码子偏爱性,化学合成四种抗菌肽(Fusion Antimicrobial Peptides,FAPs)编码基因,连接到pPICZαC载体中,构建分泌型重组表达载体并转化毕赤酵母。经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE分析获得与目蛋白大小一致特异表达蛋白条带,每升发酵液上清含量达到32 mg。初步鉴定FAPs对大肠杆菌(E.coli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌(S.syphimurium)C77-31和绿脓杆菌(P.aeruginosa)ATCC27853均有抑菌活性,且对S.aureus ATCC25923活性最强,最小抑菌浓度MIC为8.0μg·mL-1。     

重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性

参考家蝇防御素抗菌肽基因序列(AY260152) 设计4条引物,用降落PCR方法获得家蝇防御素抗菌肽成熟肽基因.将基因克隆人酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX) 启动子调控下,相对分子质量约5 000的重组抗菌肽Des-HF获得表达.抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003) 和Cowan I的攻击.     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌杀菌效果的研究

为研究抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的杀菌效果,本试验通过细胞活性检测、流式细胞术和电镜观察等方法检测在抗菌肽NZ2114作用下金黄色葡萄球菌的细胞膜完整性、细胞形态和细胞耐药程度的变化。试验结果表明葡萄球菌细胞膜可被抗菌肽NZ2114损坏,同时在电镜下细胞体积萎缩,且耐药性明显降低。证明抗菌肽NZ2114针对金黄色葡萄球菌有一定的抑制杀菌效果。     

MSL抗菌肽对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤作用研究

通过MSL抗菌肽(MSL)对细菌细胞膜的损伤作用研究,确定该抗菌肽的作用靶点。在1×108个/m L的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌悬液中,分别加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育,分别于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min离心收集上清液,检测各时间点蛋白浓度,分析蛋白浓度变化规律;分别在对数生长期的金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌悬液中加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育60min后,利用透射电镜观察分析细菌结构的变化。结果,MSL与2种细菌接触后均可引发胞液外流;透射电镜观察发现,MSL可造成绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜破损,胞浆内电子密度降低,染色质聚集,严重者细胞崩解结构不清,说明MSL对G+和G-细菌细胞膜均可造成损伤,证明细菌细胞膜是MSL作用的靶点之一。     

家蝇幼虫抗菌肽MDL-2干扰细菌功能的初步研究

研究了家蝇幼虫抗菌肽MDL-2对细菌细胞壁的溶解作用、细胞膜渗透性和代谢的影响.抗菌肽MDL-2在抗菌过程中首先与细菌的细胞壁相互作用,使其破裂.菌肽对革兰氏阴性细菌大肠杆菌的细胞壁的作用有浓度依赖性,而对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌,MDL-2在较低的浓度时即具有破坏细胞壁的作用;抗菌肽MDL-2与金黄色葡萄球菌的细胞膜作用曲线呈现典型的S型,有较强的协同效应,并随着作用时间的延长细胞的渗透性增强;抗菌肽对细菌的代谢功能有较强的干扰作用,阻碍菌体的生命活动,加速菌体死亡.     

鸡屎藤与鱼鳅串和抗生素联合抑菌试验研究

[目的]考察鸡屎藤、鱼鳅串水提物的体外抗菌活性及其与常用抗生素的联合抑菌效果。[方法]以金黄色葡萄球菌CMCC29178和大肠埃希氏菌ATCC25922标准菌株为检测菌,采用微量肉汤稀释法测定其最小抑制浓度(MIC)和联合抑菌指数(FIC)。[结果]鸡屎藤、鱼鳅串水提物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌都具有一定的抑菌效果,与常用抗菌药物合用表现出不同程度的协同或相加效应。[结论]水提法可广泛用于对具有抗菌活性的植物药材的初步筛选。     

赪桐提取物抗菌活性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌机理

[目的]揭示赪桐提取物(Extracts from Clerodendrum japonicum,EFC)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌机理,为临床抗病原菌感染药及植物杀菌剂的研发提供理论依据.[方法]采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌对EFC的敏感性,明确EFC的抗菌活性;通过试剂盒、流式细胞仪及扫描电镜等测定EFC作用后金黄色葡萄球菌细胞膜、细胞壁、三羧酸(TCA)循环、可溶性蛋白、胞内活性氧(ROS)水平、细胞凋亡及形态结构的变化,研究EFC的抗菌机理.[结果]EFC对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌3种供试细菌均具有抗菌活性,其中对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强,其抑菌圈(IZ)、最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL.经EFC作用10h后,金黄色葡萄球菌的乳酸脱氢酶(LDH)、钾离子(K+)及碱性磷酸酶(AKP)外泄分别显著增加72.0%、43.0%和78.0%(P<0.05,下同),琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性分别显著下降80.0%和36.4%.金黄色葡萄球菌经EFC作用24 h后,与对照组相比,5MIC(2.50 mg/mL)、10MIC(5.00 mg/mL)和20MIC(10.00 mg/mL)组的胞外蛋白含量分别上升28.6%、41.8%和61.5%,胞内蛋白含量分别下降40.9%、61.3%和82.5%,胞内ROS水平分别增加9.1%、33.5%和51.0%,细胞凋亡率分别增加24.0%、50.6%和72.8%.经EFC作用24 h后,扫描电镜下的菌体形态结构不规则、萎缩、畸形.[结论]EFC通过破坏金黄色葡萄球菌细胞壁和细胞膜的完整性及通透性,影响蛋白合成,导致TCA循环减慢而发挥抑菌作用.     

辣木内生真菌的分离及其抗菌活性物质的初步研究

从辣木中分离得到1株内生真菌ly14，其发酵液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和掷孢酵母有很强的抗菌作用．该菌发酵液中的抗菌物质对温度、pH及紫外线照射有较强的稳定性；ly14代谢物的理化特性表明，抗菌物质为极性酸性化合物，其紫外可见吸收光谱在276nm处出现了一个较为明显的吸收峰．     

牛血液白细胞源抗菌肽的纯化及活性鉴定

为了分离纯化牛白细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)并对其体外抗菌活性进行初步分析,以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法纯化抗菌肽,用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步纯化,用双层琼脂糖弥散法测定其抗菌活性。结果表明,通过离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性,通过RP-HPLC对阳离子峰纯化后获得了6个峰;6个峰液对大肠杆菌和沙门氏菌均具有抗菌活性,峰液F1、F2和F3对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅峰液F1对白色念珠菌具有抗菌活性。     

茶叶抗菌肽粗提物的抑菌活性及其对冷却肉保鲜的影响

为了制备茶叶抗菌肽粗提物并将其应用在冷却肉保鲜上,以龙井茶叶为材料提取茶叶抗菌肽粗提物,采用平板抑菌法检测茶叶抗菌肽粗提物的抑菌活性,通过细胞膜渗透率、磷离子泄漏、DNA结合和透射电子显微镜等指标分析茶叶抗菌肽粗提物对细菌的作用机制,通过微生物菌落数量和pH值两个指标评价茶叶抗菌肽粗提物对冷却肉的防腐保鲜效果。结果表明:提取的茶叶抗菌肽粗提物主要包括分子量小于18.4 ku的多肽,其对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有抑菌活性,可造成细菌细胞膜渗透率增强,引起细菌细胞外磷离子浓度增加,造成细菌细胞膜不完整、出现破损,但不与细菌基因组DNA结合。茶叶抗菌肽粗提物可以显著抑制冷却肉中微生物的生长,延缓pH值上升,延长保鲜时间,对冷却肉具有防腐保鲜作用,具有较高的开发利用价值。