猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35 S启动子--猪α乳清蛋白基因--终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化.利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株.对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中.     

转基因拟南芥中外源基因的Southern blot检测

外源基因在转基因植物的稳定表达是获得理想转基因植物的首要条件。在我们进行的转基因植物研究中，根据转基因植物所带有的转基因成分和标记基因的DNA序列，采用Southemblot技术对转基因植物中的猪α-乳清蛋白基因和标记基因的拷贝数进行了分析。结果表明：外源基因的拷贝数和外源基因的稳定表达相关。     

八眉猪DQA基因编码区多态性及生物信息学分析

采用克隆测序的方法对八眉猪DQA基因编码区进行多态性分析,并利用生物信息学方法预测八眉猪DQA基因的理化特性及其编码产物的结构功能。结果显示:八眉猪DQA基因编码255个氨基酸,编码区序列有14个碱基变异,11个氨基酸变异,外显子2区域表现出丰富的多态性。DQA基因编码产物是一种不稳定的水溶性蛋白,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。蛋白质功能预测结果显示,信号转导、受体、胁迫应答、免疫应答和生长因子的几率较高。研究结果为八眉猪的抗病分子育种和经济性状相关基因筛选提供理论依据。     

木薯内标准基因定性PCR方法分析

内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量PCR检测起着决定性的作用,木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础。在木薯的DFCI（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）数据库中,选择了有可能作为木薯内标基因的一些EST序列,包括亲环蛋白2（cyclophilin type 2,DB934316）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit,TC445）GAPDH、Actin 基因（TC2158与 TC3381的拼接序列）、Alpha-tubulin （TC8072）基因,Polyubiquitin（TC9946）,亚麻苦苷酶 （linamarase,TC1540）六个基因序列,设计了7对定性PCR的引物（CP2、Actin、GAPDH、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）,并进行了种内一致性、稳定性和种间特异性测试分析。结果表明只有木薯的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位的GAPDH定性PCR引物扩增系统在木薯的22个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果,在大戟科其它植物及其它非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物。另外六个基因（CP2、Actin、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）的定性PCR引物扩增系统在大戟科其它植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物。因此GAPDH定性PCR引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,可应用于转基因木薯成分定性PCR检测。     

机采紧凑型棉花类固醇5α-还原酶基因（GhDET2）单核苷酸多态性

油菜素类固醇参与了植物节间的发育过程,类固醇5α-还原酶基因(GhDET2)是调控该物质生物合成的一个关键基因。为了明确棉花不同株型种质GhDET2在基因组中的异同,本研究依据GenBank中该基因的mRNA序列设计引物,对11份适宜机采紧凑型和1份松散的棉花材料基因组DNA扩增及PCR产物测序,采用Geneious Pro软件对编码区序列进行分析比较。结果显示DET2基因在参试材料间一致性为98.9%,在编码区发现18个碱基易突变位点,其中涉及到编码氨基酸变化的碱基位点6个,其中松散型材料特异位点1个。依据氨基酸序列相似度的聚类结果与果节长度数据符合程度很好,可以推测GhDET2基因碱基序列变化引起的氨基酸的改变,可能影响油菜素类固醇的合成代谢,进而调节棉花果枝上果节的伸长。     

多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析

以多年生簇毛麦（Dasypyrum breviaristatum）基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增。扩增产物经克隆测序,获得999-1018bp的7个序列（GenBank登录号为EU186102-EU186108）,分别编码283-290个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的保守特征,是α-醇溶蛋白基因家系成员。该7个序列与乳糜泻（celiac disease）病人毒性抗原相关序列的比对结果表明,有5个序列在C末端具有Glia-α-2型抗原序列的特征。根据α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,发现来自多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白基因序列单独聚为一类,不能与普通小麦A、B或D染色体组的相关序列聚在一起。在序列分析的基础上设计了簇毛麦基因组α-醇溶蛋白基因的特异引物AS-V-gli-F和AS-V-gli-R,通过特异PCR扩增,AS-V-gli-F和AS-V-gli-R仅能对多年生簇毛麦、小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体进行特异性扩增,而不能对小麦和其他小麦族物种进行扩增。因此,AS-V-gli-F和AS-V-gli-R可作为检测多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因向栽培小麦转移的分子标记。     

新疆巴州牦牛Lfcin基因的克隆与分子特征

利用PCR技术首次从新疆巴州牦牛基因组DNA中扩增获得了乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因exon 2编码区,其中含有乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因编码区序列;利用在线生物软件对Lfcin蛋白的结构进行预测.结果表明:克隆获得了含新疆巴州牦牛LF基因exon 2的DNA序列(GenBank:EU547256),共778 bp,其中LF基因exon 2编码区长165 bp,Lfcin基因编码区长75 bp;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;各物种的Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测的Lfcin 3D模型显示,Lfcin为一段由α-螺旋和β-折叠组成的"U型"结构.首次从新疆巴州牦牛品种中克隆获得Lfcin基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛Lfcin蛋白基因工程和蛋白质功能方面的研究奠定了重要基础.     

密码子植物化的小鼠ZP3蛋白基因人工合成

对小鼠ZP3蛋白基因cDNA序列进行生物信息学分析，并将其核心区分成两部分进行分部合成。设计了多对特异性的重叠引物，采用多步PCR方法合成了植物化的小鼠ZP3蛋白基因的不同片段。再经重叠PCR技术将这两段DNA连接在一起，构成完整的ZP3基因的编码区。DNA序列测定人工合成的基因为植物化的zP3基因。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析

花青素是羽衣甘蓝叶片呈紫色、红色及粉色的重要色素,R2R3-MYB类蛋白被认为是调控植物花青素生物合成的转录因子。本研究以羽衣甘蓝叶片为试材,采用同源克隆的方法克隆BoMYB114转录因子基因的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:BoMYB114基因编码区长度为753 bp,其包含1个完整的开放阅读框ORF,可编码250个氨基酸,预测蛋白的分子量为28.5 kD,等电点(pI)为9.08。BoMYB114蛋白不存在信号肽,很可能定位在细胞核中。BoMYB114蛋白含有2个MYB保守结构域,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主。进化树分析表明,羽衣甘蓝的BoMYB114蛋白与甘蓝型油菜MYB114蛋白序列的一致性最高。羽衣甘蓝BoMYB114基因的克隆与序列特征分析对于进一步研究该基因结构和功能及植物花青素合成代谢途径具有重要意义。     

猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定

摘 要：通过克隆猪ATF4基因CDS,构建pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,为下一步在细胞水平和个体水平研究该基因功能奠定条件。提取RNA,运用RT-PCR技术和巢式PCR技术扩增猪ATF4全部编码序列,克隆转化到pMD18-T载体中,测序证实后,在克隆至真核超表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,并进行酶切和测序鉴定。在细胞水平上进行转染鉴定。成功克隆了ATF4基因,并构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,瞬时转染C2C12细胞,超表达效果明显。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

猪圆环病毒的分子生物学检测

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。     

猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27(fat specific protein 27)基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli JM109 ,检测阳性克隆并测序。猪FSP27基因的cDNA 序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-727bp,编码有238个氨基酸。同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%,氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3% 。组织分布结果显示：猪FSP27基因在多种组织均有分布。克隆的猪FSP27基因并注册GenBank (Accession.EU395789)。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

猪OGP蛋白基因克隆及分泌载体的构建与鉴定

为了获得重组猪OGP蛋白,构建OGP分泌表达载体,以使猪输卵管特异性糖蛋白在体外受精中发挥重要作用。从猪输卵管中提取总RNA,运用RT-PCR技术扩增猪OGP全部编码序列,克隆到pET22b载体中,构建成pET22b-OGP分泌表达载体,对其进行酶切、PCR和测序鉴定。结果表明：成功构建了OGP分泌表达载体,为进一步研究该OGP在猪体外受精中的功能奠定了基础。     

棉花叶绿体70S核糖体S7蛋白基因的克隆和序列分析

叶绿体基因组具有高度保守性，来源于不同植物的叶绿体基因同源性很高。应用ＰＣＲ技术，从棉花叶绿体基因组扩增并克隆了长度为１．０ｋｂ的叶绿体ＤＮＡ片段。该片段含有叶绿体核本小亚基Ｓ７蛋白基因ｒｐｓ７。采用限制性内切酶消化连接的策略构建亚克隆，并测定了该片段的含部核苷酸序列。结果表明，棉花叶绿体ｒｐａｓ７基因与烟草、不稻的相庆基因同源性高，分别为９７．９％和８９．５％，３非编码区的同源性分别为９６．３％     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。