基于PDS基因的番茄VIGS高效沉默体系的优化

病毒诱导的基因沉默（VIGS）具有独特优势,被广泛应用于基因功能验证。高效基因沉默体系的建立和优化是对目标基因功能进行研究的前提和基础。以番茄品种money maker和携带八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因序列的TRV病毒载体为材料,研究了农杆菌不同OD值、不同侵染方法以及侵染后不同培养温度对PDS基因沉默株率的影响。结果表明,农杆菌OD值分别为0.50、1.00和1.50时,PDS基因的沉默株率分别为5%、13%和6%;当农杆菌OD值为1.0时,采用注射法、真空浸润法和注射处理24h后再进行真空浸润后的PDS基因沉默株率分别为13%、30%和15%;侵染后的培养温度对于基因沉默株率也有显著影响,在25℃时的沉默株率为13%,22℃时沉默株率达到46%。以上研究表明,农杆菌OD值为1.00时,注射24h后再进行真空浸润,接种后植株在22℃下生长能够提高番茄目标基因的沉默株率。     

VIGS技术在大豆功能基因组学研究中的应用进展

病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是一种基于植物天然防御病毒保卫机制的转录后基因沉默现象。携带目的基因的重组病毒载体侵染植株引发内源基因沉默,已成为快速、高效、高通量地鉴定未知基因功能的新技术。近年,VIGS技术在研究植物抗虫抗病、代谢调控、非生物胁迫等方面取得进展。本研究介绍了大豆VIGS技术的分子机制和构建病毒载体,并对该技术在大豆功能基因组学研究中的应用进行综述,对其发展前景进行展望。     

基于VIGS技术的小麦干旱响应基因TaEF-1α的功能研究

为了进一步研究Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中的作用,首先在正常灌水和干旱胁迫2个处理下对Ta EF-1α基因在转录水平上的表达量进行了验证,并利用VIGS(Virus induced gene silencing)技术将Ta EF-1α基因进行沉默,对其功能进行研究。结果表明,Ta EF-1α基因在m RNA水平上的表达量与其蛋白水平上的变化趋势一致,均受干旱诱导上调表达。与正常灌水且未进行VIGS沉默处理的植株相比,干旱处理且未进行VIGS沉默处理的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著升高,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高;干旱条件下,与未进行VIGS沉默的对照植株相比,VIGS沉默后的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著下降,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高,植株表现出叶片下垂、对干旱胁迫敏感的表型。综合干旱处理和VIGS沉默Ta EF-1α基因后小麦植株的表型和生理指标变化,说明干旱胁迫诱导小麦植株中Ta EF-1α基因上调表达,敲低Ta EF-1α基因表达后小麦抗旱性显著下降,因此,Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中可能发挥了重要作用。     

多酚氧化酶基因NtPPOE差异表达的效应分析

为研究烟草中多酚氧化酶基因的功能,本研究从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因Polyphenol oxidase E(基因登录号:NW_015916967.1),命名为NtPPOE。构建NtPPOE基因的CRISPR载体和超表达载体,分别得到NtPPOE基因抑制/过量表达的转化植株。研究表明,基因敲除植株NtPPOE基因相对表达量降低,PPO活性降低,多酚类物质含量升高;超表达植株NtPPOE基因相对表达量升高,PPO活性升高,多酚类物质含量降低。NtPPOE基因表达量与PPO酶活性呈正相关,与多酚类物质含量呈极显著性负相关,NtPPOE基因的表达影响了烟草多酚代谢。本研究通过分析NtPPOE基因差异表达产生的效应,初步验证了NtPPOE基因的功能,并得到了NtPPOE基因抑制/过量表达的突变植株,为PPO基因功能研究和不同PPO活性品种的育种提供材料基础。     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

纯合四倍体马铃薯遗传转化体系优化及转基因块茎的褐化鉴定

以农杆菌介导的反义POT32基因对纯合四倍体马铃薯不同外植体类型进行遗传转化,发现叶片预培养2d,侵染10min,共培养3d所得的抗性愈伤组织频率最高,污染频率最低。茎段预培养2～3d,侵染8min,共培养2d能够获得较高的抗性愈伤组织频率和较低的茎外植体污染率。试管微型薯在农杆菌工程菌侵染10min时获得高达52.8%的抗性愈伤组织频率。另外,1mg/LNAA 5mg/LGA3 2mg/LZT的激素配比能够有效促进不定芽分化并提高转化频率,其不定芽及转化频率分别为12.5%和8.3%。对块茎褐化的检测结果表明,转基因块茎的褐变强度和PPO活性明显低于对照(未转基因品种),且PPO活性与褐变强度及褐变指数呈正相关(r1=0.8244**,r3=0.7524*)。损伤后的转基因块茎的褐化出现时间及褐化指数明显迟于及低于对照。     

番茄多梳蛋白家族基因LeEMF2的功能分析

多梳蛋白(Polycomb protein)在植物表观遗传调控中起重要作用。已公开的番茄转录组表明一个多梳蛋白基因Le EMF2在抗病番茄CLN2777A中受番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)诱导表达。为明确Le EMF2抗TYLCV的作用,我们以CLN2777A为材料,通过RT-PCR克隆该基因全长序列,荧光定量PCR研究Le EMF2的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术研究Le EMF2沉默后对番茄抗TYLCV的影响。Le EMF2的开放阅读框为1 917 bp,编码长为638个氨基酸的蛋白。结构域分析表明其含有一个C2H2锌指结构域以及一个VEFS盒,与拟南芥EMF2氨基酸相似度为58.3%。荧光定量PCR发现Le EMF2基因在花、根以及茎顶端生长点的表达量较高,在茎和老叶中表达量次之,在嫩叶中的表达量最低。接种TYLCV 5 d后,Le EMF2基因在CLN2777A中上调表达1倍左右,而在感病番茄TMXA48-4-0的表达则无明显变化。通过农杆菌浸润法将VIGS沉默载体注射CLN2777A子叶15 d后,Le EMF2在沉默番茄植株中的表达量仅为野生型CLN2777A的13%~48%,且沉默株的植株新叶卷曲、皱缩,说明Le EMF2基因对番茄的生长发育、形态建成具有重要作用。Le EMF2沉默植株接种TYLCV 15 d后,荧光定量PCR检测发现沉默植株的病毒量为野生型植株的1.7倍,说明Le EMF2对TYLCV的抗性作用有一定的影响。     

病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus-indcued gene silencing, VIGS)技术是指带一段包基因序列的重组病毒侵染植物,引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的植物基因功能研究的新技术。为了进一步探讨VIGS应用策略,笔者归纳了VIGS的分子机理、VIGS的载体开发和VIGS技术在植物生物逆境方面的研究应用3 个方面近些年的研究进展,得出了VIGS在植物生物逆境方面的问题及应用价值。     

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA₁超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA₁基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA₁克隆至pU1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA₁基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA₁-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA₁基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA₁超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA₁-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA₁基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA₁互作的功能蛋白奠定了基础。     

TRV病毒介导的基因沉默体系在新疆陆地棉和亚洲棉中的建立

为研究烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术应用的广谱性,以陆地棉(Gossypium hirsutum)CLA1为标记基因,通过构建基因沉默载体,在新陆早33和亚洲棉(Gossypium arboreum)建立了TRV-VIGS体系。半定量PCR分析表明,与对照相比,TRV侵染的新陆早33和亚洲棉中CLA1基因的表达均被有效抑制,真叶表现出明显的白化症状。同时在45份新陆中系列棉花材料中重复该体系,并且通过控制培养温度来检验温度对VIGS的影响,结果表明,当昼/夜温度分别为23℃/21℃和32℃/28℃时,不同品种的新陆中系列棉花均可以维持不同程度的白化表型。证明,TRV介导的VIGS可以用于室内研究新陆中系列棉花和亚洲棉基因功能。     

Partial purification and some properties of polyphenol oxidase extracted from litchi fruit pericarp

Litchi (Litchi chinensis Sonn.) fruit peel polyphenol oxidase (PPO) was partially purified 21 fold by ammonium sulfate fractionation and gel filtration. Pyrogallol, catechol, and 4-methylcatechol were good substrates for the enzyme; with no activity observed with chlorogenic acid, p-cresol, resorcinol, or tyrosine. The optimal pH for PPO activity was 7.0 with 4-methylcatechol, with the enzyme being most stable at pH 7.4. The enzyme was relatively temperature stable with maximum activity at 70 °C and requiring a little less than 10 min at 90 °C for 50% loss of activity. The K_m and V_max for the enzyme, with 4-methylcatechol, were 10 mM and 1.47 × 10⁴ units/min per mg protein, respectively. The enzyme was not activated by SDS. Reduced glutathione, -cysteine, tropolone, thiourea, FeSO₄, and SnCl₂ markedly inhibited PPO activity, whereas MnSO₄ and CaCl₂ enhanced PPO activity. Data obtained in this study might help to better understand and control commercially, litchi fruit peel browning.     

基于实时荧光定量PCR技术的蝴蝶兰PPO和PAL基因表达分析

为研究蝴蝶兰在组织培养过程中的褐化机制,通过观察与褐化相关基因PPO和PAL在组织培养过程中不同时期的表达量,判断上述两基因对褐化的影响。采用实时荧光定量的方法,设计特异性引物,获得PPO基因与PAL基因的目的片段,再以实时荧光定量方式,检验上述2个基因在蝴蝶兰组培苗中的表达量。结果表明,获得的PPO基因目的片段与蝴蝶兰x五唇兰相似性达到97%,蝴蝶兰PPO基因目的片段序列与蝴蝶兰x朵丽兰相似性达到98%。通过对蝴蝶兰组培苗培养不同阶段中PPO基因及PAL基因的表达差异研究,发现：在对组培苗叶片切割后PPO基因的表达量迅速增加,随培养时间的推移,表达量经过缓慢的降低后逐渐增高,在10天到12天阶段表达量急剧增加,在12天达到最大量,随后降低,后期表达量浮动不大;PAL基因分别在1天,8天,12天表达量急剧增加,12天的表达量最大,随后,总体表达量有降低趋势。两个基因在第12d表达量都达到最高,说明此时是褐化发生的关键时期,若此时期对其进行有效预防措施,将会减少褐化现象。     

大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS2的功能鉴定

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin, CYS)在结瘤, 根瘤发育和衰老过程中起重要作用。本研究克隆了1个大豆CYS家族基因GmCYS2, 氨基酸序列比对及进化树分析表明, GmCYS2与木豆(Cajanus cajan) CYS相似性最高。在体外对该基因编码蛋白进行了表达和纯化, 重组蛋白GmCYS2的酶活性抑制实验显示, 该蛋白对L类和B类组织蛋白酶的抑制活性明显高于对H类组织蛋白酶, 并且在30 d根瘤提取物中的抑制活性高于在60 d根瘤提取物中。此外, 构建GmCYS2的植物表达载体, 通过百脉根毛根转化法获得转GmCYS2基因的超表达复合体植株。GmCYS2的超量表达增加了百脉根的结瘤数目, 并且上调共生标记基因的表达。结果说明GmCYS2蛋白具有一定的酶活性抑制作用, 并且正调控百脉根共生结瘤过程。     

不同O2和CO2浓度梯度对酥梨采后生理及果实褐变的影响

以酥梨为试材,研究了(0±0.5)℃条件下不同O₂浓度梯度和CO₂浓度梯度的气调贮藏对酥梨采后生理及果实褐变的影响。结果表明:在贮藏期内,当CO₂浓度为0%时,随着O₂浓度的降低,在一定程度上可以延缓酥梨果肉组织相对电导率的升高、酚类物质的下降、多酚氧化酶活性的上升及色泽的转黄;但当O₂浓度为1.5%时,会对酥梨果实造成伤害,引起多酚氧化酶活性上升,果心褐变指数升高;当O₂浓度为5%时,CO₂浓度的升高有效保持了果实的硬度、色泽;但当CO₂浓度为8%时,会导致酥梨果实相对电导率增幅加大,果心、果肉酚类物质氧化加剧,果心褐变指数升高。综上所述,酥梨适宜的气调指标阈值为CO₂<2%,O₂为3%~5%。     

R2R3-MYB转录因子GmMYB184调节大豆异黄酮合成

异黄酮是一类主要含在豆科植物中的次生代谢物, 在植物防御体系中发挥重要作用, 并与人类健康密切相关。大豆异黄酮含量受多基因和复杂代谢网络控制, 调控代谢途径上的结构基因不能显著改变大豆异黄酮含量, 与异黄酮代谢途径相关的转录因子的鉴定和应用可能会有效解决这个问题。本研究克隆了一个与大豆异黄酮合成相关的R2R3类型MYB转录因子GmMYB184, 并进行了初步的功能验证。亚细胞定位研究结果表明GmMYB184转录因子定位于细胞核。组织表达分析结果表明该转录因子基因与IFS2 (异黄酮合酶2编码基因)的表达模式相同。同时, GmMYB184和IFS2的表达模式与异黄酮的积累模式相似。谷胱甘肽诱导表达分析表明该转录因子基因与IFS2共同被诱导, 说明这两个基因可能参与同一或相似的生物过程。采用双荧光素酶报告系统分析其对异黄酮合成途径关键基因的转录激活活性影响, 发现GmMYB184能够促进IFS2和CHS8启动子表达活性分别提高5倍和7倍。最后, 通过发根农杆菌介导的遗传转化系统, 找到该转录因子在异黄酮合成调控中的直接作用证据。沉默GmMYB184导致大豆毛状根异黄酮含量的显著下降。但是, 过表达GmMYB184不足以显著提高毛状根中异黄酮的含量。总之, 本研究为大豆异黄酮合成分子机制探索及大豆异黄酮品质改良提供了理论依据。