RNA干扰对烟草NtPPO8基因沉默的效应分析

多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。     

反义PPO基因对马铃薯块茎褐化的影响

对刚收获和贮藏5个月后的12个转基因马铃薯品系及对照块茎进行褐化指标的生理检测,发现2个检测时期的各褐化指标在供试品系间差异均达到显著或极显著水平。综合2个检测时期并与对照相比,PPO活性降幅为26.01%~48.65%;酚物质含量降低22.83%~54.81%;褐化强度除GD-9-qc-1低于对照40.45%~46.78%外,其余品系高于对照或与对照无差别。切割块茎发现,大部分转基因品系较对照褐化出现晚,褐化程度低,褐化指数低于对照88.0%~98.86%。PPO的化学定位显示,低褐化转基因品系的多酚氧化酶集中于维管束环,含量明显少于对照,其中GD-9-qc-1仅有少量多酚氧化酶显现出来,推测是由于反义PPO基因抑制块茎POT32基因表达的结果。进一步的方差、相关分析表明,除对多酚氧化酶含量抑制外,反义PPO基因还降低酚物质含量以减轻块茎损伤褐化。     

蚜虫取食诱导高粱多酚氧化酶(PPO)基因的表达及酶活性分析

多酚氧化酶(PPO)在植物防御病虫害中发挥了重要作用。为了探明PPO在高粱对高粱蚜的防御反应中所发挥的作用,本研究利用抗蚜品种HN16和感蚜品种BTx623两种材料,对高粱中8个PPO基因接虫3 d和5 d的表达模式进行了分析,并对同一时期的PPO活性进行测定。结果表明,在蚜虫取食过程中,在感蚜品种BTx623中,随着蚜虫取食时间的延长,除PPO3外,其他7个PPO基因的表达量均呈现先上升,后降低的趋势;而在抗蚜品种HN16中,8个PPO基因的表达量持续上升,PPO的酶活也有所升高,可见,PPO在HN16的抗虫反应中发挥着一定的主动防御功能,在这个过程中,3个成员PPO1,PPO5和PPO6可能起了主要作用。     

超声处理对鲜切马铃薯褐变的影响

以鲜切马铃薯为研究对象,研究不同超声处理对鲜切马铃薯在4℃下贮藏过程中L值、a值、b值、总酚含量、抑制多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化物酶(POD)活性变化。结果表明,超声处理能有效抑制鲜切马铃薯亮度和色度的变化,降低总酚含量,抑制PPO和POD的活性;其中,25℃下300 W超声处理8 min效果最佳。     

盐角草甜菜碱合成相关基因的共表达提高转基因烟草的耐盐性

植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）和胆碱单加氧酶（CMO）是甜菜碱合成过程中的关键酶。本文将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列（Mar）利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物表达载体pYLTAC747N-Mar-SePEAMT-SeCMO-Mar。该载体用电击转化法转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR检测确定转基因植株。在含250mM NaCl的MS培养基上35d后,转基因植株生根而野生型植株不能生根;转基因烟草植株甜菜碱积累量显著高于野生型植株,约是野生型植株的5.6~7.7倍;转基因植株与野生型相比,相对电导率显著降低,叶绿素含量明显升高。以上结果表明共表达SePEAMT 和SeCMO能有效提高烟草甜菜碱表达量从而提高烟草的耐盐性。     

黄瓜白粉病抗性及生理机制的研究

研究了黄瓜不同抗性品种在接菌前后酶活性与酚类物质含量的变化。结果表明：黄瓜对白粉病的抗性与植株组织中的过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶活性以及酚类物质含量密切相关。不同抗性黄瓜品种对白粉病的抗性与PPO活性、酚类物质含量可能存在一定的正相关。     

超量表达AtBAS1基因影响烟草叶片腺毛发育

烟叶腺毛是烟草(Nicotiana tabacum)香气物质合成的主要场所,对烟叶的香气品质有重要影响。为探索拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phyB activation-tagged suppressor1,BAS1)基因对烟草叶片腺毛发育的影响,构建pSH-35S-BAS1超量表达载体遗传转化烟草,对烟草叶片腺毛发育进行研究。结果表明转基因烟草腺毛数量比野生型烟草腺毛提高了32.5%,推测BAS1基因的表达可能引起了腺毛发育相关基因表达的改变。根据研究报道烟草萜类化合物环化酶基因(nicotiana tabacum cultivar T.I.1068 cyclase gene,NtCTTC)、细胞色素P450加氧酶基因(nicotiana tabacum cytochrome P450 gene,CYP71D16)和烟草表面抗性蛋白基因(nicotiana tabacum phylloplanin,NtPhP)均在腺毛上特异性表达。通过q-PCR分析烟草腺毛发育的相关基因在转基因烟草和野生型烟草中的表达情况,得到结果,NtCTTC、CYP71D16和NtPhP基因在转基因植株中的相对表达量分别是野生型植株中的34.16、1.26和8.95倍。综上可知,BAS1基因在烟草中超量表达引起了腺毛发育相关基因表达的上调,从而增加了烟草腺毛的数量。本研究为外源基因对烟草腺毛密度以及调控烟草腺毛发育研究提供了借鉴。     

海岛棉GbMFT2基因能提高烟草的耐盐能力

MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein,PEBP)家族,该家族在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。本课题组前期从海岛棉(Gossypium barbadense)中克隆了一个MFT-like同源基因GbMFT2,发现其在种子中表达量较高,并且受ABA诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究首先检测了200 mmol/L Na Cl胁迫海岛棉0、1 h、3 h、6 h、12 h后基因的表达量,表明在盐诱导1 h GbMFT2基因的表达量最高。然后构建了过量表达载体p35S:GbMFT2,并通过农杆菌介导的叶盘法将其转化到普通烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中,半定量RT-PCR表明GbMFT2基因在烟草中异位表达成功。利用0、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L和500 mmol/L Na Cl胁迫不同的转基因株系,表明转基因烟草比野生型烟草更耐盐。再分别测量300 mmol/L Na Cl处理前后的野生型烟草和转基因烟草的脯氨酸含量、POD活性,发现处理后的野生型烟草的脯氨酸含量、POD活性均明显降低,而转基因烟草株系中的脯氨酸含量、POD活性均有明显的提升。研究结果表明,GbMFT2基因能够响应盐胁迫,并增加烟草的耐盐性。本研究可为研究植物MFT-like基因的功能提供了新思路,也为进一步解析棉花发育基因的功能提供了研究基础。     

葡萄多酚含量和多酚氧化酶（PPO）活性与组培苗生根关系的初步研究

研究测定了葡萄属10个种(品种)组培苗的多酚含量和多酚氧化酶(PolyphenolOxidase,PPO)的活性,对其与组培苗的生根指数进行相关性分析,并建立生根指数与多酚含量、多酚氧化酶的多项式回归方程。结果表明:不同种(品种)间多酚含量和PPO活性有显著性差异;多酚含量和PPO活性相关性显著,PPO活性和生根指数不相关,而多酚含量与生根指数呈显著负相关;从回归方程可以看出,PPO活性对生根指数的作用是非线性的,多酚含量对生根指数的作用是线性的,这说明多酚含量对组培苗生根的直接作用很大,PPO活性通过多酚含量间接影响组培苗生根而且直接作用较小。     

转hpa1Xm基因烟草后代的分子检测及苗期生理生化指标测定

本研究以野生型三生烟(Nicotiana tabacum cv.Xanthi nc.)及T_2、T_3代转hpa Xm(即hpa1Xm)基因烟草和转hpa Xm N-端缺失突变体(标记为hpa Xm△LP)烟草为试材,对目标基因的整合表达、叶绿素含量及防御酶活性进行检测。结果表明,卡那霉素抗性筛选、PCR及RT-PCR检测证明,外源目的基因hpa Xm和hpa Xm△LP整合到烟草基因组中,在转录水平上正常表达,且两个世代中稳定遗传。叶绿素含量测定中,转基因烟草含量显著高于野生型植株,同种转基因植株T_2代含量显著高于T_3代,而转hpa Xm基因烟草的总叶绿素含量比转hpa Xm△LP基因烟草的高,无显著性差异。防御酶活性的测定,表明转基因烟草的PAL、POD和PPO活性皆显著高于野生型植株;而转hpa Xm基因烟草的PAL和POD活性显著高于转hpa Xm△LP基因烟草;同品种转基因烟草中,T_2代PAL活性显著高于T_3代。说明hpa1Xm基因在烟草中表达能显著提高其叶绿素含量及抗病防御酶活性水平,且不同世代的转基因烟草之间表现有所差异。初步探索了hpa Xm的功能、遗传稳定性及信号肽类似序列对hpa Xm的表达及功能的影响。     

不同干燥条件对山富士苹果总多酚及多酚氧化酶活性的影响

利用热风干燥,在40,50,60,70℃的干燥条件下,将日本山富士苹果片干燥至干基含水率分别为50%,20%。对其总多酚含量以及多酚氧化酶活性进行分析。结果表明,在2种含水率下,总多酚含量均在70℃干燥条件下呈现最大;在含水率为50%时,多酚氧化酶活性在60℃最小;在含水率为20%时,50℃干燥条件下多酚氧化酶活性最大。     

转基因纯合四倍体马铃薯多酚氧化酶活性及同工酶谱的变异

选择14个已插入反义PPO基因的纯合四倍体马铃薯“GD-9-qc”系列,进行叶片、微型薯PPO活性检测和同工酶分析,结果表明,不同品系间的叶片、微型薯PPO活性存在极显著差异,其中2个品系的叶片及8个品系的微型薯PPO活性明显低于对照;供试转基因品系间的叶片PPO同工酶谱带的颜色深浅表现差异,所示结果与PPO活性检测基本一致;     

多酚含量及多酚氧化酶活性与柑橘胚性愈伤组织褐化的关系

研究测定了9种不同品种/基因型柑橘胚性愈伤组织的多酚含量和多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）的活性,对其与柑橘愈伤组织褐化的关系进行了探讨。结果表明,不同柑橘品种/基因型间多酚含量和PPO活性有明显不同;多酚含量高的宽皮柑橘类胚性愈伤组织容易褐化,葡萄柚与甜橙类的次之,说明柑橘胚性愈伤组织褐化与多酚含量成正相关;PPO活性与柑橘愈伤组织褐化无明显相关。     

茉莉酸甲酯对烟草抵御棉铃虫的诱导作用

为进一步阐明茉莉酸甲酯（MeJA）诱导植物抗虫的机理,研究了外源MeJA对烟草多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）活性及编码氢过氧化物裂解酶（HPL）和蛋白酶抑制剂（PI-I和PI-II）基因表达的诱导作用,并对棉铃虫取食烟草叶片面积及其体重进行了生物学测定。结果表明,用100 μmol/L MeJA处理后,烟草体内PPO、POD和LOX活性显著升高,HPL、PI-I和PI-II表达明显增强,叶片被取食面积减少,棉铃虫体重增加变慢。说明MeJA对诱导烟草抵御棉铃虫有重要作用。     

不同植物生长调节剂对烤烟生长发育的影响

为深入了解植物生长调节剂对烤烟生长发育的影响,以云烟87为试验材料,采用大田试验的方法,研究微生物菌剂、生根粉和表油菜素内酯对烤烟农艺性状、抗氧化酶、多酚氧化酶、根系活力以及烤后烟叶化学成分的影响。结果表明,施用植物生长调节剂对烟株农艺性状、根系活力、过氧化指标相关酶类和烟叶化学成分均有影响。随着烟株的生长,各处理过氧化物酶（POD）活性逐渐升高,多酚氧化酶（PPO）活性呈现降-升-降的趋势。与对照和施用表油菜素内酯相比,施用微生物菌剂灌根和生根粉浸根提高了烤烟的株高、茎围、最大叶长、最大叶宽和有效叶片数;在移栽后45d提高了POD和PPO活性,增强了根系活力,使烤后烟叶化学成分更加协调。综合来看,施用微生物菌剂灌根和生根粉浸根能够改善烤烟的生长发育情况,提高烟叶品质。     

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

提取酿酒酵母DNA，PCR法合成片段长度为1902bp的NHX1基因，构建植物高效表达载体转化烟草，经PCR扩增、GUS酶染色分子鉴定后，应用荧光定量PCR分析转化材料幼根NHX1基因的转录水平，并将各转化材料T1代烟苗移栽至中间试验隔离圃中，化验分析烟叶内在成分。获得抗卡那霉素、NHX1基因PCR扩增和GUS染色阳性的转化子42株，在转化材料幼根中可检测到外源基因NHX1转录的mRNA分子；烟叶内在成分化验结果表明T1代转化材料烟叶含钾量增加30％，总糖含量显著降低，证明NHX1基因除了与Na^＋运输有关还与K^＋的吸收和糖分运输有关。     

3种农药对烤烟旺长期叶绿素含量及相关酶活性的影响

为了研究大田中常用3种化学农药对烤烟旺长期生理活性的影响,选用3种不同农药(氧化乐果乳油、乙酰甲胺磷乳油、吡虫啉可湿性粉剂),测定其在烟苗旺长期对烤烟叶片的叶绿素含量和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、硝酸还原酶(NR)、转化酶(InV)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)等5种酶活性的影响。结果表明,喷施3种农药均不同程度地降低了叶片中叶绿素含量、NR和InV活性,并随着烟草生育期的推进,上述指标均有所提高;而IAAO,PAL和PPO活性在施药后明显增加,随着烟草生育期的推进回落明显。这3种农药对烟草叶片中不同的生理活性指标有着不同程度的影响。