超微量DNA模板扩增鉴定绵羊早期胚胎性别体系优化

本实验旨在运用超微量胚胎DNA模板扩增SRY基因鉴定绵羊早期胚胎性别PCR体系和方法优化.根据绵羊Y染色体性别决定SRY基因的723 bp的保守序列设计引物,析因法建立巢式PCR体系,联合扩增SRY和GAPDH基因,经绵羊静脉血液和胚胎超微量DNA样本调整测试灵敏度后,切割40枚绵羊桑椹胚的少量胚细胞进行性别鉴定,并对...     

利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究

利用牛性别决定基因(SRY)和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR和多重巢式PCR,用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的多重PCR扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但在常规PCR体系中,它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。而由二者建立的巢式PCR灵敏度可达到5pg,故可以很好地满足胚胎性别鉴定的需要。     

常规PCR和巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别体系的建立和优化

试验利用牛Y染色体重复序列作为雄性特异性引物,_以肿蔼坏死因子(TNFα)为内标引物建立多重PCR和多重巢式PCR体系,进行牛早期胚胎性别鉴定.共设计4对引物-Y染色体重复序列外引物和内引物,其扩增片段大小分别为534 bp和480bp,肿瘤坏死因子外引物和内引物,扩增片段大小分别为357 bp和272 bp.结果表明,4对引物均有很高的特异性和稳定性;多重PCR体系灵敏度为50 pg(约8个细胞),多重巢式PCR体系灵敏度为10 pg(约2个细胞),故多重巢式PCR体系更适合于牛胚胎性别鉴定.     

不同PCR法对牛性别鉴定的影响研究

为建立一种有效的牛早期胚胎PCR性别鉴定方法,试验以12头已知性别的牛全血为试验材料,提取基因组DNA,分别运用常规PCR法、多重PCR法和巢式PCR法进行牛性别鉴定研究,用2对SRY(Y染色体性别决定区)引物和1对牛特异性引物扩增牛核基因组DNA进行牛性别鉴定,建立3种牛性别鉴定的PCR反应体系。结果表明,3种方法准确率均为100%,其中巢式PCR法检测灵敏度可达13pg,多重PCR法整个鉴定过程约需3h。     

牦牛胚胎性别鉴定PCR反应体系的建立

研究旨在建立牦牛胚胎性别鉴定准确、可靠的PCR反应体系及研究切割取样对胚胎发育能力的影响.根据牦牛SRY和HSL基因序列分别设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物和2对引物作为内标引物,通过优化PCR反应条件,对已知性别牦牛血液基因组DNA和牦牛杂种胚胎DNA采用巢式PCR进行性别鉴定.结果表明,血液样本性别鉴定与实际性别完全相符,准确率100%.从早期胚胎取8个细胞进行性别鉴定,结果雄性为45.8%(11/24),雌性为54.2%(13/24),取样后胚胎发育率为56.7%.结果说明已成功建立牦牛胚胎性别鉴定的PCR体系.     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系优化的研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛-珠蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255 bp的-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255 bp的-珠蛋白基因片段。由于巢式PCR只需3～8个细胞就可以在紫外灯下看到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

云南黑山羊性别决定基因体外扩增研究

对云南黑山羊 (10♂ ,2♀ )的基因组DNA性别决定基因 (SRY)进行了体外PCR扩增的研究 ,结果表明适当引物可特异性扩增出雄性个体的性别决定基因片段 (大小约为 185bp) ,而对雌性个体则不能扩增出任何片段 ;研究还利用已筛选出的性别决定基因特异性引物对少量的胚胎细胞进行了特异性扩增 ,检测了 2 0枚云南黑山羊的胚胎 ,其中有 5枚胚胎可扩增出约为 185bp的特异性片段。以上结果为山羊胚胎早期性别鉴定奠定了技术基础。     

OPS法冷冻小鼠胚胎的双重套式PCR性别鉴定

本实验利用双重套式PCR扩增小鼠SRY、ZFX基因序列对OPS冷冻胚胎进行性别鉴定。同一胚胎 4份平行样品性别检验结果均一致则胚胎鉴定准确 ,否则鉴定失败。共检测 6 0枚桑椹胚 ,雄性一致有 35枚 ,雌性一致有 2 3枚 ,鉴定失败有两枚 ,可鉴定率为 96 .7% (5 8/ 6 0 )。并对影响双重套式PCR扩增效率的因素进行了分析     

水牛胚胎性别鉴定的PCR方法

根据荷斯坦牛SRY基因设计1对引物扩增得到水牛SRY基因的全长序列2 005 bp,对该片段测序后,设计2对特异于水牛SRY基因核心区的引物用于早期胚胎性别鍪定,同时根据水牛G3PDH基因设计,2对引物作为内对照共同扩增,建立了多重巢式PCR体系并进行优化,使用优化后的PCR体系对取样后的27枚IVF胚胎和24枚Y精子受精胚胎进行检测,并使用斑点杂交检测扩增准确率.结果表明,27枚IVF胚胎均能有效扩增,雄性、雌性比例分别为51.9%(14/27)、48.1%(13/27),斑点杂交表明扩增准确率为100%;24枚Y精子受精胚胎的雄性比例为83.3%(20/24).该巢式多重PCR方法具有很高灵敏度和稳定性,能够在实际生产中应用.     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

哺乳动物胚胎性别鉴定试剂盒的研究

依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物SRY基因高度同源性设计一对22 bp的SRY引物,按照3×2×3因子组合,建立了PCR扩增胚胎DNA最适条件。采用此最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA,结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物胚胎的性别。采用设计的性别鉴定引物,按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。     

奶牛性别鉴定的研究与应用

选取牛雄性性别决定基因SRY (sex region of Y chromosome),根据基因序列设计特异引物,应用PCR技术对5头荷斯坦奶牛DNA样品进行扩增,鉴定其性别;并对设计的引物灵敏度进行检测;对已有的公、母各20头荷斯坦奶牛DNA样品进行PCR盲检,获取奶牛高灵敏度特异性引物,用于奶牛性别鉴定。结果表明,4头公牛DNA样品可以扩增出目标条带(66 bp),1头母牛DNA样品无法扩增出条带,阴性对照扩增无条带;最佳引物灵敏度为1.6 pg/μL,可以很好地满足性别鉴定需要。40头个体中,20头个体DNA样品可以扩增出条带,其余20头个体DNA样品无法扩增出条带,检测结果与实际性别对比准确率为100%。试验结果表明,设计的引物灵敏度比较好,能够满足奶牛性别鉴定的需要。     

Sexing of pre-implantation ovine embryos through polymerase chain reaction-based amplification of GAPDH,SRY and AMEL genes

The ability to identify the sex of embryo and control of sex ratio has a great commercial importance to livestock industry. Prediction of embryonic sex could be useful in the management decisions of sex selection in breeding programs. Several methods have been attempted to determine the sex but the polymerase chain reaction (PCR)-based sexing method is generally favoured, as it is cost effective, simple and reliable. The aim of the present study was to identify sex of sheep embryos produced in vitro through amplification of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), sex-determining region Y (SRY) and amelogenin genes present in genomic DNA (gDNA) of embryos through PCR. To avoid false interpretation of the result by no amplification of SRY in female embryos, a duplex PCR was approached to amplify combinedly SRY and GAPDH genes. Sex-specific blood was used in PCR as positive control. In vitro sheep embryos were produced as per standardized protocol of laboratory. Sexing of sex-specific blood and in vitro produced embryos were approached though PCR to amplify the respective genes using gDNA present in the sample without its traditional isolation. The accuracy of sex prediction for embryos was 100% by this procedure.     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

A single blastomere sexing of caprine embryos by simultaneous amplification of sex chromosome-specific sequence of SRY and amelogenin genes

The primary objective of this study was to develop a simplified, rapid and authenticated protocol for sexing of caprine embryos. Polymerase chain reaction (PCR) is a powerful tool in preimplantation sex diagnosis, using embryo biopsy at the early developmental stage. Based on the amelogenin gene located on the conserved region of the sex chromosome, a primer pair was used and PCR was established to amplify a 262-bp fragment from the Xchromosome in female goat embryos and 262-bp fragments from the X chromosome and 202-bp fragments from the Y chromosome in male embryos. To validate the reliability of PCR, using the sex-determining region Y (SRY) gene located on the conserved region of Y chromosome, a primer pair was used and PCR was established to amplify a 122-bp fragment specific to the Y chromosome in male embryos. The in vitro-produced goat in vitro fertilisation (IVF)-embryos were made zona free by treating with pronase. The cell number in each embryo was counted before sexing. A single blastomere taken from these embryos was directly used as a template in PCR containing SRY and amelogenin gene-specific primers separately. Of 75 pronase-treated and 60 micromanipulated goat IVF embryos, 33 (44%) and 26 (43.33%) were confirmed as male and 42 (56%) and 34 (56.66%) as female, respectively. The sex-diagnosed embryos were kept in research vitro cleavage (RVCL) medium, and developed into 42.66% and 61.66% morulae and 13.33% and 23.33% blastocysts among pronase-treated and micromanipulated embryos, respectively. The AMELX gene-specific primer served as the internal control and did not interfere with amplification of the Y-specific sequence. In conclusion, a single blastomere sexing protocol based on the SRY and the amelogenin gene is simple, rapid, sensitive and efficient for sex determination in caprine early stage embryos.     

PCR扩增ZFY,ZFX序列鉴定奶牛性别的灵敏度研究

从克隆、测序所得奶牛ＺＦＹ、ＺＦＸ序列中设计１对高特异性引物（或探针），即分别特异于牛ＺＦＹ、ＺＦＸ的ＺＦ３、ＺＦ４，与克隆时使用的引物ＺＦ２搭配成ＺＦ２、ＺＦ３和ＺＦ２、ＺＦ４。利用这２对引物和ＺＦ１、ＺＦ２对奶牛基因组ＤＮＡ进行ＮｅｓｔＰＣＲ来判断性别，结果达到用超微量（８ｐｇ）ＤＮＡ，即可检出ＺＦＹ、ＺＦＸ序列而判定雌雄的灵敏度；用非同位素标记试剂盒（ＤＩＧ－Ｓｙｓｔｅｍ）标记ＺＦ３、ＺＦ４作为探针，对ＺＦ１、ＺＦ２扩增产物点杂交来判断性别，也达到同样的灵敏度     

应用Sry-PCR扩增鉴定狍(Capreolus capreolus)的性别

根据人的SRY基因核心序列设计合成1对引物C1、C2，应用PCR技术对野生狍(Capreolus capreolus)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增．结果在野生狍雄性样本扩增出1条带(221bp)．而在雌性样本未见扩增带．显示了Sry基因的性别特异性。应用这1对引物对42个未知性别狍肌肉组织样本进行了性别鉴定．结果雄性22个，雌性20个。对Sry-PCR产物克隆测序，得到185bp的Sry基因部分核苷酸序列。本试验为狍种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。     

鉴定牛体外培养胚胎性别的一种新PCR方法及其应用

根据已知序列设计了2对引物,分别在体外扩增SRY基因及1个常染色体基因,能同时扩增出2个基因的胚胎为雄性,只能扩增出常染色体基因的胚胎为雌性。通过该方法对50个卵母细胞进行PCR验证,有49个扩增出1条常染色体基因,准确率为98％;鉴定了48枚用普通精液受精所得胚胎及57枚用经SRY抗体处理的精液受精所得胚胎的性别,雌性比例分别为56％和82％。