小麦生理型与遗传型雄性不育相关基因锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)及果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)的表达分析

锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)是一种重要的抗氧化剂,果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)是叶绿体光合碳化阶段起重要调节作用的关键酶.本研究以小麦(Triticum aestivum L.)生理型与遗传型等基因雄性不育系及其对应育性正常的保持系为材料,选取花粉小孢子发育各时期的花药及三核期子房,对供试材料花药全蛋白表达差异研究的基础上,对雄性不育相关基因(Mn-SOD)及FBA进行核酸水平的实时荧光定量PCR分析,结果发现,与可育保持系相比,(1)生理型雄性不育系Mn-SOD基因在幼穗期、单核期和三核期表达量显著下调,而酶活力在幼穗期上调,在单核期下调;遗传型雄性不育系Mn-SOD基因在幼穗期和单核期表达量下调,酶活力在幼穗期上调,在二核期下调.(2)生理型雄性不育系和遗传型雄性不育系FBA基因表达量在幼穗期和单核期均下调,而对应同时期的FBA酶活力也下调,而遗传型不育系FBA基因在三核期表达量和FBA酶活力均上调.(3)Mn-SOD和FBA在遗传型雄性不育系三核期子房和花药中表达量均高于生理型雄性不育系和正常可育系,而在生理型雄性不育系花药中,Mn-SOD表达量明显低于对照可育系,在子房中其表达量略高于正常可育系.基因表达具有组织特异性,其蛋白表达较基因表达具有一定滞后性.Mn-SOD基因过量表达(单核至二核期),从而清除花药代谢紊乱产生的过多的活性氧,维持细胞正常功能;而花粉败育(生理型和遗传型雄性不育)导致花药失去活力,从而使花药叶绿体光合能力下降,FBA下调表达.研究结果提示,不同发育时期FBA及Mn-SOD酶活力变化与基因表达水平相一致,且这两个指标的变化直接或间接的影响了小麦花药的育性程度.     

小麦生理型雄性不育系中天冬氨酸蛋白酶与绒毡层代谢的相关性分析

为探讨化学杂交剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育系花药绒毡层细胞凋亡过程与花粉粒败育的关系,以小麦生理型雄性不育系及其可育系花药为试验材料,结合前期绒毡层细胞凋亡研究的结果,采用透射电镜超微观察花药绒毡层细胞结构,定量检测与凋亡相关的天冬氨酸蛋白酶相关基因(APs1、APs2、APs3)的表达量,同时利用含明胶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对天冬氨酸蛋白酶活性进行验证。结果表明,在小麦花药发育单核期,生理型雄性不育系花药绒毡层细胞较可育系绒毡层细胞提前降解;在四分体至三核时期,3个天冬氨酸蛋白酶基因在不育和可育系中均表现为先升高后降低的趋势,且单核期表达量最高;天冬氨酸蛋白酶相关基因(APs1、APs2、APs3)在花药发育单核时期以及四分体时期,不育系较可育系均明显上升;天冬氨酸蛋白酶活性研究表明,在花药发育各时期该酶活性在不育系与可育系中均表现出明显差异,且在不育及可育系花药中天冬氨酸蛋白酶活性都呈先升高后降低的趋势,在二核期活性达到最高。表明在SQ-1诱导的生理型不育系中,天冬氨酸蛋白酶的变化与绒毡层细胞凋亡、结构变化及雄性不育花粉粒败育密切相关。本研究初步揭示了生理型小麦败育的机理,为进一步深入研究小麦雄性不育机理,培育能广泛应用于生产实践的优良不育系提供了一定的理论依据。     

小麦生理型雄性不育花药中能量相关基因的表达

为揭示小麦(Triticum aestivum L.)生理型雄性不育机理,以化学杂交剂SQ-1为诱导剂,构建了普通小麦西农1376不育和可育生理系,用RT-PCR技术分析了3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和NFUDP4基因在不同发育时期的不育和可育花药中的表达差异.结果表明,与同期对照相比,GAPDH和NFUDP4基因在不育花药单核期到三核期均下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,GAPDH下调表达尤为显著.因此,小麦生理型雄性不育花药败育过程中,一方面由于GAPDH基因表达受抑制,使糖酵解受阻导致能量供应不足;另一方面,NFUDP4基因下调表达,可能引起线粒体某一Fe-S族蛋白装配需要的分子骨架减少而使其数量不足,从而可能引起Fe-S族蛋白参与的生化反应减弱,如呼吸链电子传递受阻引起能量供应不足,与小麦生理型雄性不育具有一定关系.     

小麦生理型雄性不育花药中能量相关基因表达

为揭示小麦(Triticum aestivum L)生理型雄性不育机理, 以化学杂交剂SQ-1为诱导剂,构建了普通小麦西农1376不育和可育等生理系,用RT-PCR 技术分析了3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和NFUDP4基因在不同发育时期的不育和可育花药中的表达差异。结果表明,与同期对照相比,GAPDH和NFUDP4基因在不育花药单核期到三核期均下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,GAPDH下调表达尤为显著。因此,小麦生理型雄性不育花药败育过程中,一方面由于GAPDH基因表达受抑制,使糖酵解受阻导致能量供应不足;另一方面,NFUDP4基因下调表达,可能引起线粒体某一Fe-S 族蛋白装配需要的分子骨架减少而使其数量不足,从而可能引起Fe-S族蛋白参与的生化反应减弱,如呼吸链电子传递受阻引起能量供应不足,与小麦生理型雄性不育具有一定关系。     

小麦生理型雄性不育系中反式烯脂酰-CoA还原酶基因(TaECR)的克隆及表达分析

超长链脂肪酸(VLCFAs)代谢在花药发育中发挥着重要的作用,而反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸合成的脂肪酰-CoA延长酶之一.为进一步研究杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机理,根据己报道二穗短柄草(Brachypodium distachyon)ECR基因,采用电子克隆获得序列并设计引物,从小麦(Triticum aestivum)中克隆ECR的开放阅读框cDNA序列,命名为TaECR,将该序列提交至GenBank,登录号为KC222053.序列分析表明,TaECR基因编码310个氨基酸,具有反式烯脂酰-CoA还原酶的经典结构域.表达分析表明,TaECR基因在小麦花药、颖片、叶和根中均有表达,其中在根中的表达量最底;与可育系相比,TaECR基因在生理型不育系三核期中表达急剧下调,在单核期和二核期表达趋势无显著变化,并与其蜡质积累量变化趋势基本一致,这表明TaECR基因调节的超长链脂肪合成途径可能参与了SQ-1诱导的败育过程.     

杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花药蛋白质组分分析

采用固相pH梯度SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术对杀雄剂SQ-1处理和未处理的小麦单核期、二核期花药总蛋白进行了分离，通过考马斯亮蓝G-250染色，获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。通过PDQuest 2DE图像分析软件的分析，在等电点(pI)4～7之间可识别约500个以上较为清晰的蛋白质点，处理和对照各时期蛋白质在等电点5～6，分子量20～40kD之间相对较集中；检测到单核期差异点43个，二核期差异点45个，并计算出了各差异点的分子量和等电点。其中11个点在处理材料的单核期缺失而在对照中表达，7个在处理中表达而在对照中缺失，14个点表达量在处理中明显减弱，而另外11个明显增强；在二核期45个差异点中，有13个在处理中缺失而在对照中表达，7个在处理中表达而在对照中不表达，12个表达量在处理中明显减弱而另外13个明显增强。经SQ-1处理后在单核期和二核期A-Z3（26.8/5.7）和C-Z5（26.8/5.7）点均缺失。点A-L10(26.8/5.9)在单核期处理的表达量下调，而到了二核期完全缺失C-Z6（26.9/5.9）点。通过双向电泳技术获得的这些差异蛋白可能直接或间接地参与了花药发育的各个途径，因此，处理和对照图谱中表现出的差异蛋白很可能与SQ-1诱导小麦雄性不育有关。     

异源细胞质对小麦雄性不育系主要农艺性状、花粉粒核分裂及花药绒毡层降解的影响

为了更好地利用核质互作小麦雄性不育系并解析不同类型细胞核与异源细胞质互作对花药绒毡层细胞及花粉粒核分裂特征的影响,本研究以2套核(偃师9号细胞核和90-110细胞核)质(K型、B型、S型、V型和Ven型细胞质)互作雄性不育系及其保持系(偃师9号保持系和90-110保持系;偃师9号细胞核属1B/1R类型;90-110细胞核属非1B/1R类型)为材料,调查其主要农艺性状(株高、穗长、穗下节间长和分蘖数),观察不育系及其保持系花药绒毡层降解和花粉粒核分裂特征。结果表明,核质互作雄性不育系细胞核是1B/1R类型或非1B/1R类型时,其农艺性状受细胞质类型的影响,且存在不同程度的差异。S-偃师9号花粉粒核分裂异常发生在单核早期,属典败型;Ven-偃师9号花粉粒核分裂异常发生在单核晚期,属典染杂合型;K-偃师9号和V-偃师9号花粉粒核分裂异常发生在二核期,属染败型;B-偃师9号花粉粒核分裂异常发生在三核期,属染败型。K-90-110与S-90-110花粉粒核分裂异常发生在单核晚期,分别属染败型和圆败型;V-90-110和Ven-90-110花粉粒核分裂异常发生在二核期,V-90-110属染败型,Ven-90-110属典染杂合型;B-90-110花粉粒核分裂异常发生在三核期,属染败型。V-偃师9号和Ven-偃师9号花药绒毡层细胞降解异常发生在单核早期,K-偃师9号和B-偃师9号花药绒毡层细胞降解异常发生在二核期,而S-偃师9号花药绒毡层细胞降解异常发生在三核期;B-90-110、S-90-110和Ven-90-110花药绒毡层细胞异常降解发生在单核早期,K-90-110和V-90-110花药绒毡层异常降解发生在单核晚期。上述结果表明,异源细胞质分别与1B/1R类型细胞核和非1B/1R类型细胞核间存在互作模式的差异,会不同程度地影响核质互作雄性不育系的农艺性状,同时引发花药绒毡层细胞差异性代谢异常,最终导致花粉粒核分裂异常,产生不同的败育类型。本研究为进一步揭示小麦核质互作雄性不育机理和更好地利用异源细胞质提供了理论依据。     

小麦辐射雄性不育系杂种F_1的亚显微结构

本文以辐照普通小麦种子获得的普通小麦细胞质雄性不育系85EA、89AR 和具提莫菲维小麦细胞质的TA 型(Tc ms)3 个异质同核( 原冬3 号) 稳定的雄性不育系与2 个高恢复力的恢复系原恢3 号和BPM15( 普通小麦品种) 杂种F1 代为材料,研究它们雄配子发育单核、二核及三核各时期的亚显微结构。结果表明,85 EA、89 AR、TA 与恢复系杂交F1 代小孢子发育表现出明显的可育特征:在单核期,细胞质浓,细胞器丰富,线粒体、内质网等十分发达,二核及三核期淀粉粒数量多。但85EA、89 AR杂种F1 在单核期比TA 杂种F1 内质网和核糖体数量多,这可能是85EA 和89 AR 新雄性不育类型育性容易被恢复的重要原因之一。     

四环素调控基因(TetO)诱导重编程的猪体细胞系建立

建立含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA的第二代猪(Sus scrofa domesticus)成纤维细胞,使其在添加强力霉素(doxycycline,DOX)而无需再次感染病毒的条件下可以重编程。将慢病毒(Lentiviral)质粒四环素调控基因(TetO)-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF),在添加DOX的培养条件下,形成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。随后,将iPSCs通过形成拟胚体(embryoid body,EB)再分化为成纤维样细胞,即TetO-PEF细胞。TetO-PEF携带TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA两个载体,且外源四因子拷贝数一致,在+DOX条件下调控四因子表达,直接驱动细胞重编程。本研究建立了TetO-PEF细胞系,为优化猪iPSCs培养条件提供了新的细胞资源。     

大菱鲆心脏细胞系的建立与鉴定

为丰富海水鱼类细胞系的数量,提供更多的基因功能研究及病毒分离、鉴定工具,本研究建立了一种新的细胞系,大菱鲆心脏细胞系(Scophthalmus maximus heart cell line,SMH).该细胞系使用组织块法(tissue block method)启动原代培养,培养液是添加了胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、人类碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、抗生素、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)的DMEM/F 12.结果显示,SMH形态呈典型的成纤维细胞样,在培养液中生长分裂旺盛,经230 d传代培养,成功传至58代.用带有绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)的pEGFP-N3质粒转染SMH,发现GFP在细胞中成功表达,转染效率为40％左右.使用遗传霉素(geneticin,G418)对重组质粒细胞进行筛选,得到了一簇荧光表达效率高的细胞.染色体分析表明,具有正常二倍体核型(2n=44)的细胞占64％.线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase sub-unit Ⅰ,CO Ⅰ)基因鉴定出该细胞系来源于大菱鲆.该细胞系的建立为大菱鲆功能基因及其他基于细胞系的研究奠定了基础,对大菱鲆的病毒感染途径和分子机制研究具有重要的理论意义.     

转基因玉米NK603基体标准物质研制

由于转基因标准物质的缺乏,无法保证检测结果的准确、可靠和可比。本研究将筛选后的转基因玉米(Zea mays)NK603 阳性材料及受体进行研磨筛分,粒径测定结果表明,研磨后的粒径大小为 100 μm左右。采用重量法配置了 3 个不同水平的转基因玉米基体物质,应用实时荧光定量 PCR 方法对研制的标准物质进行均匀性和稳定性检测,统计结果表明,所研制的基体标准物质均匀性良好;在 4 ℃保存条件下,一年内未发现不稳定现象。重量法确定的标准值和扩展不确定度(k=2)分别为(0.50±0.10)%、(1.00±0.35)%和(5.00±0.35)%。同时选择 7 家实验室进行协同验证,结果表明,研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质量值准确可靠,与国外标准物质相比,不确定度水平相当。本实验研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质适用于转基因玉米 NK603 的定量检测。     

新城疫病毒（NDV）-F基因（NDV-F）稳定表达P815细胞株的建立

在成功构建新城疫病毒(NDV)-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导法,将其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株(P815),经过加入G418(600 靏/mL),筛选得到稳定的细胞克隆株,并进一步扩大培养.应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞提取物在1 600bp处出现目的条带.收集转染细胞,经Westernblot和免疫荧光法检测到表达的目的蛋白.将获得的细胞株在液氮中冻存6个月后检测,该细胞株仍能很好表达NDV-F基因,表明其具有高度稳定性,证明采用脂质体法已成功地建立了能够稳定表达NDV-F基因的细胞株.     

晋东南-南阳-荆门1000KV特高压输变电工程（湖北段）水土流失监测

以国内首条特高压输变电工程晋东南－南阳－荆门1000kv特高压输变电工程（湖北段）为例,详细给出了该工程水土保持监测情况,包括监测范围、内容及方法。通过监测和归纳,得出特高压输变电工程水土流失特点和2007、2008年的水保监测数据。结果表明：特高压输变电工程的水土流失量随着时间的推移逐步减少。     

Characterization of Soil Types and Subtypes in N-Dimensional Space of Multitemporal (Empirical) Soil Line

A classical soil line (SL) in the RED–NIR spectral space is specified by two coefficients “a” and “b.” In this form, it does not characterize soil types and subtypes. A multitemporal soil line (MSL) represents the major axis of the ellipse describing all possible pairs of RED–NIR values characterizing a bare soil surface for a given pixel of remote sensing images. The MSL in the RED–NIR spectral space is specified by several (N) coefficients. The resulting N-dimensional space of MSL coefficients makes it possible to give unique characteristics for each type and subtype of soils in the following zonal soil sequence: soddy-podzolic soils, light gray forest soils, gray forest soils, dark gray forest soils, podzolized chernozems, and leached chernozems. The analysis of variance allows us to state that the soils of this sequence significantly differ from one another in the characteristic sets of MSL coefficients. In other words, these coefficients characterize soil types and subtypes, and the MSL can be considered an empirical soil line (ESL) of the given type and subtype of soil. A classical SL is an integrity of ESLs of different soils within the given scene of remote sensing data.     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)启动子的克隆与表达

为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪.     

小麦-大麦大穗大粒渐渗系WB13的分子细胞学鉴定

小麦新种质WB13是普通小麦(Triticum aestivum L.)品种7182与农家二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.distichon Hsü.)杂交后回交多代衍生而来的大穗大粒材料。为了明确WB13的遗传基础,本研究利用形态学、细胞学、分子标记及特异片段回收测序等技术对其进行了鉴定。结果表明,采用小麦不同同源群简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对WB13和小麦7182进行遗传背景分析发现,两者遗传相似系数(genetic similarity coefficient,GS)达97.0%,田间表现为大穗、大粒,综合农艺性状较好;根尖细胞染色体数目为2n=42,以大麦基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)未出现杂交信号;利用大麦特异序列标签位点(sequence-tagged site,STS)标记对WB13和农家二棱大麦进行扩增,发现ABG054(4H)和ABC305B(7H)两个标记在WB13中扩增出了大麦特征条带(分别记为WS1和WS3),经测序及序列比对,发现其与扩增到的大麦序列分别具有100%和98%的相似性,与EMBL数据库中的序列比对,与两者有相似性的全为大麦的序列。利用大麦4H和7H染色体上的35对SSR引物对WB13及其亲本进行扩增,发现与千粒重相关的标记MGB396(4H)在WB13中扩增出了大麦的特异条带。综合以上结果确定WB13含有大麦4H和7H染色体的遗传物质,为小麦-大麦渐渗系材料,且4H染色体渗入片段中可能携带与千粒重相关的有益基因。本研究确定了WB13为小麦-大麦杂种后代,此材料的育成丰富了小麦-大麦中间材料和大穗大粒材料的种质资源。同时本研究在分子水平上初步揭示了WB13大穗大粒特性的成因,为后续构建遗传分析群体进行相关数量性状(quantitative trait loci,QTL)定位及推动WB13的研究利用积累了基础资料。